分析基因导入位点的方法技术

一种在整合了反转录病毒载体的染色体ＤＮＡ中分析载体附近的来源于染色体的ＤＮＡ区域的方法，其特征为在存在可降低双链核酸Ｔｍ值的化合物时进行引物延伸反应和核酸扩增反应。进一步提供了用于本方法的试剂盒和缓冲液。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用来分析转基因细胞中染色体上基因整合位点的方法。
技术介绍
基因治疗是，例如，通过提供正确的遗传信息来修复细胞功能、或通过添加细胞中原本没有的新的“保护基因”，来治疗或预防诸如由于细胞中“遗传信息错误”所导致的遗传病或者癌症这样的难治性疾病的疗法。已知基因治疗中将基因转移到细胞中的方法包括使用病毒载体的方法、通过内吞作用、电穿孔或基因枪转入裸DNA的方法、以及使用诸如脂质体这样的转基因试剂的方法。病毒载体应用在包括基础和临床用途在内的多种用途的基因治疗领域。例如，腺病毒载体适用于在靶细胞中大量地瞬时表达某个基因。在另一方面，期望反转录病毒载体可用于遗传病的基因治疗和转基因动物生产领域，这是因为反转录病毒载体可将目的基因稳定整合至宿主的染色体中，使该基因长期稳定表达。但是，由于根据反转录病毒转移基因的方法，目的基因是随机整合在宿主染色体上的，而已知整合位点会使细胞具有癌化的可能。因此，对宿主染色体上反转录病毒介导的基因整合位点进行分析以及用于测定被测细胞群的克隆种类(单克隆，寡克隆及多克隆)的灵敏监测是非常重要的。反向PCR方法(参见J.Virol.，631924-1928(1989))或LM PCR方法(参见Science，246780-786(1989))是常用的分析病毒、转座子、转基因等在染色体DNA中的插入或整合位点的方法。但是，已知这些方法存在诸如低检测灵敏度(需要较多的模板DNA)或低特异性这样的问题。随后，发展了线性扩增介导的PCR(LAM PCR)方法来克服这些问题(参见WO 00/24929；Blood，1002737-2743(2002))。根据该方法，首先进行的是以染色体DNA为模板，用一条引物进行线性PCR。引物与作为反转录病毒特征的序列——长末端重复(LTR)序列互补，并在其末端用生物素标记。在线性PCR中，仅用一个引物扩增对应于该引物退火位置下游部分的单链DNA。用固定了链亲和素的磁珠吸收线性PCR的产物，从而有效回收具有LTR序列及来源于染色体序列的扩增的单链DNA片段。通过合成互补链而将单链DNA转变成双链DNA。用识别4个碱基序列并切割双链DNA序列的限制性内切酶切割双链DNA。将称为接头盒的双链DNA连接到末端。用所获得的连接产物为模板，通过一个与LTR互补的引物和一个与接头盒互补的引物进行PCR。从而扩增包含LTR与来源于染色体的LTR侧翼DNA在内的DNA片段。因此可分析反转录病毒的整合位点。另外，可通过使用琼脂糖凝胶等回收PCR扩增片段、将其亚克隆到合适的载体、并测定片段的核苷酸序列的方式，来分析宿主染色体DNA中的整合位点。与传统方法相比，依据这一方法可提高检测灵敏度。此外，该方法的优势在于使用磁珠简化了样品在反应步骤间的纯化过程，并降低染色体DNA作为模板的量。然而，如果所分析的染色体DNA来源于具有多个不同的整合位点的(多克隆)的生物样品群体，使用目前的反应条件可能会依据作为模板的DNA的种类与数量的差异，导致对来源于特定克隆的片段进行偏向性扩增的现象。在这种情况下，扩增的结果并不反映所用样品的细胞群中所存在的克隆的实际状态。此外，可能无法检测到样品中的低丰度的克隆。因此，传统的LAM PCR方法在其灵敏度、重复性和精确性方面存在问题。因此，难以获得可反映转基因细胞群的实际状态的信息，作出正确的判断。如上所述，LAM PCR方法目前被认为是一个用来分析通过逆转录病毒载体来进行整合的基因的有效系统。不过，该方法需要进行改进，从而精确地、灵敏地、重复性地监测在多个位点整合逆转录病毒的生物样品(多克隆，寡克隆或单克隆)确定群体中具有整合基因的细胞在怎样的范围内存在，或特定细胞在群体中的比例。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是改进传统的用LAM PCR方法分析整合位点的方法，从而构建一个，例如，对于具有多个逆转录病毒介导的基因整合位点的细胞群，通过PCR反应可扩增更多的整合片段而不偏向来自某个特定克隆的片段的系统，其中群体中所含的特定扩增片段可被灵敏地检测出来。从而，可高灵敏度高重复性地判断被测细胞群中克隆的种类(单克隆，寡克隆，多克隆)，并监测细胞群中特定细胞的含量。作为为完成上述目标而进行的透彻研究的结果，本专利技术人已发现，通过在存在用于降低双链核酸Tm值的化合物的情况下，构建一个引物延伸反应，改善包括PCR条件在内的反应方案，由此对非偏向性扩增的片段进行灵敏的检测，从而完成本专利技术。本专利技术的第一个方面涉及分析整合有逆转录病毒载体的染色体DNA中逆转录病毒载体侧翼的来源于染色体DNA的区域，该方法包括(1)使用其序列与反转录病毒载体LTR的核苷酸序列互补的引物、以整合了反转录病毒载体的染色体DNA为模板，进行引物延伸反应，从而获得引物延伸产物；(2)回收步骤(1)获得的引物延伸产物，并合成与引物延伸产物互补的DNA，从而获得双链DNA；(3)对步骤(2)获得的双链DNA末端加上双链寡核苷酸；并且(4)以步骤(3)获得的添加了寡核苷酸的双链DNA为模板，以与反转录病毒载体LTR核苷酸序列互补的序列为一个引物，另一个引物的序列与所述双链寡核苷酸的核苷酸序列互补，进行核酸扩增反应，从而获得扩增产物，其中步骤(1)中的引物延伸反应和步骤(4)中的核酸扩增反应是在可降低双链核酸Tm值的化合物存在的条件下进行的。根据第一方面中的方法，步骤(1)中的引物延伸反应和/或步骤(4)中的核酸扩增反应可通过聚合酶链式反应进行。在聚合酶链式反应中可使用包含具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的DNA聚合酶组分。例如，聚合酶链式反应的温度循环由95℃，60秒；58℃，45秒；和72℃，90秒所构成。作为第一方面的方法中所用的可降低双链核酸Tm值的化合物的例子，可以是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜和四甲基铵盐的某种物质。例如三甲铵基乙内盐可用作一种甜菜碱。在第一方面的步骤(4)中可使用两步聚合酶链式反应。在第一方面的步骤(3)中，可用限制性内切酶消化步骤(2)中获得的双链DNA，从而将双链寡核苷酸加到产生的双链DNA末端。步骤(1)中的染色体DNA可以预先用的限制性酶消化。根据第一方面，可在步骤(1)中使用具有标记的引物，通过步骤(2)的标记来回收引物延伸产物。例如进行生物素标记。第一方面的方法可进一步包括测定步骤(4)中所获得的扩增产物的核苷酸序列的步骤。例如，在本方法中，可通过以将步骤(4)中获得的产物整合到载体上而得到的重组DNA为模板来测定其核苷酸序列。本专利技术的第二方面涉及测定整合了反转录病毒载体的染色体DNA上反转录病毒载体侧翼的来源于染色体DNA的核苷酸序列的试剂盒，该试剂盒包括(a)可与反转录病毒LTR部分退火的引物；(b)接头盒；(c)可与(b)中接头盒退火的引物；(d)DNA聚合酶；(e)限制性内切酶；及(f)包含可降低双链核酸Tm值的化合物的用于引物延伸反应的缓冲液。第二方面的试剂盒中所包含的DNA聚合酶可以是包含具备3’外切酶活性的DNA聚合酶和不具备3’外切酶活性的DNA聚合酶的混合物的DNA聚合酶组分。可降低双链核酸Tm值的化合物的例子，可以是选自甜菜碱、甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)和四甲基铵盐的某本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分析整合了反转录病毒载体的染色体ＤＮＡ上，反转录病毒载体侧翼的、来源于染色体的ＤＮＡ的区域的方法，该方法包括：　　　　（１）以与反转录病毒载体上ＬＴＲ核苷酸序列互补的序列为引物，以整合了反转录病毒载体的染色体ＤＮＡ为模板进行引物延伸反应，从而得到引物延伸产物；　　　　（２）回收步骤（１）获得的引物延伸产物，并合成与引物延伸产物互补的ＤＮＡ，从而得到双链ＤＮＡ；　　　　（３）在步骤（２）获得的双链ＤＮＡ末端加上双链寡核苷酸；及　　　　（４）以步骤（３）获得的添加了寡核苷酸的双链ＤＮＡ为模板，以与反转录病毒载体上ＬＴＲ的核苷酸序列互补的序列为一个引物，与所述双链寡核苷酸核苷酸序列互补的序列为另一个引物进行核酸扩增反应，从而获得扩增产物，　　　　其中步骤（１）的引物延伸反应和步骤（４）的核酸扩增反应在可降低双链核酸Ｔｍ值的化合物存在下进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：友野润，H上野，武田理，向井博之，佐川裕章，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]