一种全基因合成方法技术

本发明专利技术涉及一种全基因合成方法，命名为STRP法(single tube reverse PCR‑based gene synthesis,STRP)。该方法仅需要一轮PCR反应、DpnI酶消化和大肠杆菌转化，在一天内即可完成。首先合成覆盖靶基因的寡核苷酸，相邻的寡核苷酸末端相互重叠，最外侧的寡核苷酸与质粒载体插入位点两侧序列同源。将所有寡核苷酸与质粒载体混合，在一轮PCR反应中，合成目的基因，同时将目的基因整合至质粒载体中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)纯化寡核苷酸，利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，可以降低合成基因中的突变。采用本方法，可以合成1638bp的DNA。实验证明，该方法是一种简单有效的全基因合成工具，适合高通量基因合成和载体构建。

A method of whole gene synthesis

The invention relates to a method for gene synthesis, named STRP (single tube reverse PCR based gene synthesis, STRP). This method requires only one round of PCR reaction, DpnI enzyme digestion and Escherichia coli transformation, which can be completed in one day. First, oligonucleotides covering target genes were synthesized. The ends of adjacent oligonucleotides overlap each other. The outermost oligonucleotides are homologous with the two sides of plasmid insertion sites. In a round of PCR reaction, all the oligonucleotides were mixed with plasmid vectors, and the target genes were synthesized and the target genes were integrated into the plasmid vector. By polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) purified oligonucleotides, using high fidelity DNA polymerase for PCR amplification, can reduce the mutation in a synthetic gene. By using this method, the DNA of 1638bp can be synthesized. The experiment proved that this method is a simple and effective whole gene synthesis tool, which is suitable for high throughput gene synthesis and vector construction.

【技术实现步骤摘要】
一种全基因合成方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种全基因合成的方法。
技术介绍
全基因合成在合成生物学中具有关键的作用，包括异源蛋白表达、基因改造和修饰以及全基因组合成等。通过基因合成，不仅可以根据序列获得自然界中存在却难以获取的基因，也可以对密码子进行优化，或者随意对基因进行改造。基因合成方法的进步极大地提升了人们对基因和蛋白的操作能力。基因合成主要由两种方式介导：连接酶和PCR。PCR介导的全基因合成是使用最为广泛的方法，其主要包括以下几个步骤：首先设计合成覆盖目的基因的相邻末端重叠的寡核苷酸，在第一阶段PCR中，DNA延伸合成全长的目的基因，在第二阶段PCR中，采用最外侧的一对引物，富集目的基因，最后通过酶切连接，将目的基因克隆至质粒载体中。许多报道的方法均在此基础上改进，包括热动力平衡/内向外的方法(TBIO)、传统热平衡方法(TBC)、改进的PCR介导的合成(IPS)等。另外，有报道采用一步法(onestepmethod)进行基因合成，然而，该方法需要较多的参数优化，包括DNA聚合酶、引物浓度和退火温度方面，过程繁琐。传统的全基因合成方法通常需要至少三天的时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)引物设计：设计覆盖目的基因全长的寡核苷酸即引物；(2)酶链聚合反应：将所有步骤(1)设计的寡核苷酸与质粒载体混合在一管中进行PCR反应，基因合成在一轮PCR中完成：寡核苷酸互相退火延伸，形成长片段；长片段以质粒载体为模板进行退火、成指数反向PCR方式延伸、扩增，得到含有全长目的基因的线性质粒，通过一轮PCR反应，可以同时合成目的基因并将目的基因整合到质粒载体中；(3)DpnI酶消化及转化：采用DpnI酶消化步骤(2)得到的PCR产物，把质粒载体从线性质粒上消化去掉，将消化产物转化大肠杆菌感受态细胞并涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上培养；(4...

【技术特征摘要】
1.一种全基因合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)引物设计：设计覆盖目的基因全长的寡核苷酸即引物；(2)酶链聚合反应：将所有步骤(1)设计的寡核苷酸与质粒载体混合在一管中进行PCR反应，基因合成在一轮PCR中完成：寡核苷酸互相退火延伸，形成长片段；长片段以质粒载体为模板进行退火、成指数反向PCR方式延伸、扩增，得到含有全长目的基因的线性质粒，通过一轮PCR反应，可以同时合成目的基因并将目的基因整合到质粒载体中；(3)DpnI酶消化及转化：采用DpnI酶消化步骤(2)得到的PCR产物，把质粒载体从线性质粒上消化去掉，将消化产物转化大肠杆菌感受态细胞并涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上培养；(4)菌落PCR筛选及测序验证：挑选在步骤(3)制备的含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上长出的菌落，进行菌落PCR，电泳，筛选长度正确的克隆，检测是否得到目的基因；(5)原核表达验证合成的基因是否具有功能：采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的方式，验证合成基因在BL21(DE3)中的表达。2.如权利要求1所述的一种全基因合成方法，其特征在于，所述步骤(1)具体操作如下：从数据库调取基因序列，根据大肠杆菌密码子偏好性，对编码序列进行优化，手动或在线软件设计覆盖目的基因全长的寡核苷酸即引物，包括2个最外侧引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化寡核苷酸，根据Tm值设置相邻引物之间的重叠区，使相邻引物末端能够在PCR反应时相连，质粒载体插入位点一侧与一个最外侧的引物3’端序列同源，质粒载体插入位点另一侧与另一个最外侧的引物3’端序列同源。3.如权利要求1所述的一种全基因合成方法，其特征在于，所述步骤(2)PCR条件如下：PCR体系为：1×缓冲液，40pmol-2pmol混合引物即步骤(1)设计的引物，0.4mMdNTP，1mMMgSO4，1U高保真DNA聚合酶和1ng-50ng质粒载体；PCR反应包括两个阶段，第一阶段反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸，10个循环，第一阶段过程中，引物即寡核苷酸互相退火延伸，形成不同的长片段，部分长片段由最外侧引物和寡核苷酸退火延伸而成，所以该部分长片段包括含有与质粒载体插入位点一侧同源序列的长片段以及含有与质粒载体插入位点另一侧同源序列的长片段；第二阶段反应条件：94℃预变性2min，98℃变性10...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，陈智毅，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：广东,44