cfDNA建库方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于cfDNA建库的随机接头、cfDNA建库方法及试剂盒。使用本发明专利技术的随机接头进行cfDNA建库，可以提高文库得率。

CfDNA library method and kit

The present invention relates to a random joint, a method of building a cfDNA and a kit for the building of a cfDNA library. The use of the random joint of the invention to build the cfDNA library can improve the yield of the library.

【技术实现步骤摘要】
cfDNA建库方法及试剂盒专利
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及cfDNA建库方法及试剂盒。
技术介绍
Illumina测序设备是现在新一代高通量测序(NGS)的常用设备之一，配套使用的是KAPA文库构建试剂盒。附带的DNA文库构建说明书提到的文库构建方法简述如下：(1)末端修复后纯化；(2)加A并纯化；(3)接头连接并纯化；(4)再次纯化；(5)文库扩增并纯化产物。KAPA试剂盒配套的接头序列如下(F为正向序列，R为反向序列)：F:5’---AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACT---3’；R:5’---ACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG---3’。经修复加A后的cfDNA上的A碱基与接头上的T碱基配对连接，连接成功后的cfDNA就可以通过illumina设备进行测序。现有的KAPA接头试剂的文库转化效率(建库前后DNA的比例)较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于cfDNA建库的接头、cfDNA建库方法及试剂盒。根据本专利技术的一个方面，提供用于cfDNA建库的随机接头，所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：F:5’---AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(N)xGTCAGTACT---3’(SEQIDNO:1)R:5’---GTACTGCA(N)xAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG---3’(SEQIDNO:2)其中，N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50％。由于N是随机碱基，因此当N为不同碱基时可形成不同序列，这些不同序列退火形成的不同双链序列的混合物构成本专利技术的随机接头。因此，本专利技术中，所使用的随机接头是混合物，其中含有N为不同碱基时形成的不同序列退火而成的多条不同的双链序列。在本专利技术中的随机接头混合物中，不同序列中的N的数量都是相同的，但N的碱基种类不同。例如，优选地，本专利技术的随机接头可以是由上述序列退火形成的多条不同双链序列的混合物，其中x为6。本专利技术的随机接头还可以是由上述序列退火形成的多条不同双链序列的混合物，其中x为8。根据本专利技术的另一方面，提供上述随机接头的制备方法，包括：将合成好的两条序列分别稀释至10μM的浓度；然后分别取20μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95℃，孵育5min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2小时；获得制备好的随机接头。根据本专利技术的另一方面，提供上述随机接头在cfDNA建库中的应用。根据本专利技术的另一个方面，提供cfDNA建库方法，包括下述步骤：(1)末端修复后纯化；(2)在已修复的cfDNA片段的3'端加上一个“A”碱基，并纯化；(3)用DNA连接酶将随机接头连接至已加A的cfDNA片段的两端，并纯化，所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：F:5’---AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(N)xGTCAGTACT---3’(SEQIDNO:1)R:5’---GTACTGCA(N)xAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG---3’(SEQIDNO:2)其中，N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50％；(4)再次纯化加接头的cfDNA片段；(5)通过PCR扩增文库并纯化产物。在优选的实施方案中，步骤(3)中所使用的随机接头的制备方法是：将合成好的两条序列分别稀释至10μM的浓度；然后分别取20μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95℃，孵育5min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2小时；获得制备好的接头。在更优选的实施方案中，步骤(3)中随机接头与cfDNA的比例为5-300:1，更优选为10-100:1，最优选为10-50:1。所述比例为质量比。在一些实施方案中，步骤(1)-(5)中任意一步或多步中所述的纯化是利用磁珠纯化。根据本专利技术的又一方面，提供一种cfDNA建库试剂盒，所述试剂盒包含随机接头，所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：F:5’---AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(N)xGTCAGTACT---3’(SEQIDNO:1)R:5’---GTACTGCA(N)xAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG---3’(SEQIDNO:2)其中，N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50％。在一些的实施方案中，所述试剂盒还包含cfDNA建库所需的一种或多种其它试剂。本专利技术中，随机接头中N的数量，即x可以为3-20中的任何一个数，优选为6-8中的任何一个数，更优选为6或8。利用本专利技术的随机接头和cfDNA建库方法获得的文库，可适用于Illumina测序平台。使用本专利技术的随机接头进行cfDNA建库，可以提高文库转化效率。附图说明图1是由细胞系cfDNA构建的文库所得到的Caliper峰图，其中“KAPA”表示KAPA建库试剂盒配套接头的文库峰图；“随机引物”表示随机接头的文库峰图，在158bp位置出现一个dimer峰。其中细胞系cfDNA是由细胞系的基因组DNA经酶切成cfDNA大小的DNA，即模拟的cfDNA。图2是由血浆cfDNA构建的文库所得到到Caliper峰图，其中“KAPA”表示KAPA建库试剂盒配套接头的文库峰图；“随机引物”表示随机接头的文库峰图，在169bp位置出现一个dimer峰。具体实施方式本专利技术所述的术语“文库构建”简称建库，是指，对于血液、体液或粪便等样本中存在的cfDNA进行修复并连接到一段已知DNA片段即adapter序列(也称为接头)上，从而可以用于Illumina设备上进行高通量DNA测序的过程。本专利技术所述的术语“cfDNA”又称细胞游离DNA(cellfreeDNA)，是体内处于游离状态的DNA。本专利技术的“RandomAdapter(随机接头)”是退火完成后的双链接头。本专利技术所述的术语“退火”是游离的单链DNA通过一系列反应形成双链DNA的过程。本专利技术所述的“LoBind离心管”是一种具有低吸附性的离心管。本专利技术所述的“磁珠”是指超顺磁性纳米颗粒，能够帮助DNA产物核酸进本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于cfDNA建库的随机接头，所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：F:5’‑‑‑AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T(N)xGT CAG TAC T‑‑‑3’(SEQ ID NO:1)R:5’‑‑‑GTA CTG CA(N)xA GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT CAC ATC ACG ATC TCG TAT GCC GTC TTC TGC TTG‑‑‑3’(SEQ ID NO:2)其中，N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3‑20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40‑50％。

【技术特征摘要】
1.用于cfDNA建库的随机接头，所述随机接头是由如下所示的序列退火形成的多条不同双链序列的混合物：F:5’---AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(N)xGTCAGTACT---3’(SEQIDNO:1)R:5’---GTACTGCA(N)xAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG---3’(SEQIDNO:2)其中，N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个；N的数量，即x为选自3-20中的一个数；且每一条序列中C+G含量保持在40-50％。2.根据权利要求1的随机接头，其中x为6或8。3.权利要求1或2的随机接头的制备方法，包括：将合成好的两条序列分别稀释至10μM的浓度；然后分别取20μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95℃，孵育5min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2小时；获得制备好的随机接头。4.c...

【专利技术属性】
技术研发人员：李福根，金其煌，陈阅军，
申请(专利权)人：埃提斯生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31