专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA 的方法技术

本发明专利技术涉及一种专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法，步骤如下：⑴收集样品细胞、⑵裂解细胞、⑶去除蛋白、⑷沉淀DNA、⑸乙醇洗涤、⑹溶解DNA、⑺保存DNA，将DNA样品做好标记，放于指定位置‑20℃或‑80℃中保存。本发明专利技术提供的方法相较于离心柱法和磁珠法，大大降低实验成本，相较于离心柱法和磁珠法，大大缩短DNA提取时间，相较于离心柱法，大大提高DNA提取的量。DNA纯度在合理的区间范围之内。提取得到的基因组DNA不影响下游的分子实验。

A method for rapid and rapid extraction of DNA in oral epithelial cells

The invention relates to a method for rapid extraction of DNA, epithelial cells of oral steps are as follows: 1, the cell samples were collected, the cell lysis protein removal, the precipitation of DNA and the DNA, such as ethanol washing, dissolved, save DNA, DNA sample mark, placed on the specified position of 20 DEG C or 80 degrees to save. Compared with the centrifugal column method and the magnetic bead method, the method provided by the invention greatly reduces the experimental cost. Compared with the centrifugal column method and the magnetic bead method, the DNA extraction time is greatly shortened, compared with the centrifugal column method, the amount of DNA extraction is greatly improved. The purity of DNA is within a reasonable range. The extracted genomic DNA does not affect the downstream molecular experiments.

【技术实现步骤摘要】
专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法
本专利技术属于分子生物学实验领域，尤其是一种专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法。
技术介绍
基因检测是通过提取被测者的血液、其他液体或者组织细胞对DNA进行检测的技术。目前，随着生物技术的发展，基因检测已经逐步成为继传统体检以外的新兴的疾病健康检测手段。脱氧核糖核酸(DNA)提取是基因检测的一个基本步骤，也是整个基因检测的基础，核酸的浓度和纯度的质量直接关系到后续的检测能否成功。相较于传统体检，基因检测可以直接提取被测者的口腔上皮细胞的DNA，具有无痛无创口的优势。因此，口腔上皮细胞DNA的提取，成为基因检测的主流DNA提取方法。目前，市场上，用于口腔上皮细胞DNA提取的方法主要分为离心柱法和磁珠法。离心柱法的主要原理是：离心柱中的膜可以对细胞破碎后的DNA的进行特异性的吸附，其余的细胞裂解物由于不能吸附在离心柱上，而被巨大的离心力甩出离心柱，最后对膜进行洗脱而得到所需的DNA。离心柱法的主要缺陷是特异性吸附柱对DNA的吸附效率不高，从而导致得到的DNA的量相对较少。磁珠法的主要原理大体与柱提法相似，即通过可对DNA特细异性吸附的磁珠，使用清洗液对其它的细胞裂解物进行去除。最后由于磁珠具有磁性，可以吸附在磁力架上，所以特异性吸附的DNA不会被清洗，从而达到分离纯化DNA的目的。由于特异性吸附DNA的磁珠不可重复使用，而且其造价较贵，所以导致磁珠法成本较高。而且这2种方法的操作步骤较为繁琐，需要花费较长的时间。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提取口腔上皮细胞基因组的DNA方法，能够稳定高效的提取口腔上皮细胞基因组DNA。本专利技术实现目的的技术方案如下：一种专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法，步骤如下：⑴收集样品细胞用2个口腔拭子分别刮取口腔左右两侧的口腔上皮细胞，并把拭子头转移到2个含1ml去离子水的1.5ml的离心管中；震动离心管，使细胞从拭子上尽可能多的脱落，然后将2个含有口腔上皮细胞的1.5ml管离心，转速：800×g，时间：2分钟；吸弃上清液，每个EP管加入500μl的无菌水，将其中一个EP管的细胞转移到另一个EP管中，离心，转速：800×g，时间：2分钟；⑵裂解细胞吸弃上清液，向每管中加入500μl的溶液A，溶液A含9.5mmol/L的Tris-Cl，2mmol/L的EDTA，1％的SDS，3％的Triton-100，pH＝8.5，加后加入50μl浓度为1mg/ml的蛋白酶K溶液，涡旋振荡10秒钟，放入55℃水浴内15分钟；每5分钟振荡一次；⑶去除蛋白短暂离心，将管壁上的残留液体离至管底；加入200μl的醋酸钠-冰醋酸溶液，剧烈振荡20秒钟，管中出现白色絮状物；12000×g离心3分钟，使白色物质沉淀到离心管底部；⑷沉淀DNA吸取400-500μl的上清液到新的EP管中，加入800μl溶液B，溶液B组成为无水乙醇：异丙醇＝1:3，振荡10秒钟，使上清液与异丙醇充分混合；12000×g离心3分钟；⑸乙醇洗涤吸弃上清，加入800μl的75％乙醇，振荡5秒钟，12000×g离心2分钟；吸弃上清，重复上述步骤一次；⑹溶解DNA小心吸弃上清，室温下敞口干燥10分钟；将DNA溶解到100μl的无菌水中；⑺保存DNA将DNA样品做好标记，放于指定位置-20℃或-80℃中保存。而且，所述醋酸钠-冰醋酸溶液为3M的Na+，5M的Ac-。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的方法相较于离心柱法和磁珠法，大大降低实验成本，相较于离心柱法和磁珠法，大大缩短DNA提取时间，相较于磁珠法，大大提高DNA提取的量。DNA纯度在合理的区间范围之内。提取得到的基因组DNA不影响下游的分子实验。附图说明图1为口腔上皮细胞基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果图；图2为qPCR的扩增曲线；表1为不同样本口腔上皮细胞基因组DNA浓度、纯度的检测结果。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。一种专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法，步骤如下：⑴收集样品细胞用2个口腔拭子分别刮取口腔左右两侧的口腔上皮细胞，并把拭子头转移到2个含1ml去离子水的1.5ml的离心管中。震动离心管，使细胞从拭子上尽可能多的脱落，然后将2个含有口腔上皮细胞的1.5ml管离心，转速：800×g，时间：2分钟。吸弃上清液，每个EP管加入500μl的无菌水，将其中一个EP管的细胞转移到另一个EP管中，离心，转速：800×g，时间：2分钟。⑵裂解细胞吸弃上清液，向每管中加入500μl的溶液A(含9.5mmol/L的Tris-Cl，2mmol/L的EDTA，1％的SDS，3％的Triton-100，pH＝8.5)，加后加入50μl浓度为1mg/ml的蛋白酶K溶液，涡旋振荡10秒钟，放入55℃水浴内15分钟。每5分钟振荡一次。⑶去除蛋白短暂离心，将管壁上的残留液体离至管底。加入200μl的醋酸钠-冰醋酸溶液(3M的Na+，5M的Ac-)，剧烈振荡20秒钟，管中出现白色絮状物。12000×g离心3分钟，使白色物质沉淀到离心管底部。⑷沉淀DNA吸取400-500μl的上清液到新的EP管中，加入800μl溶液B(无水乙醇：异丙醇＝1:3)，振荡10秒钟，使上清液与异丙醇充分混合。12000×g离心3分钟。⑸乙醇洗涤吸弃上清，加入800μl的75％乙醇，振荡5秒钟，12000×g离心2分钟；吸弃上清，重复上述步骤一次。⑹溶解DNA小心吸弃上清，室温下敞口干燥10分钟。将DNA溶解到100μl的无菌水中。⑺保存DNA将DNA样品做好标记，放于指定位置-20℃或-80℃中保存。实验数据采用市面上常见的三种基因组DNA提取试剂盒E.Z.N.AMag-BindsForensicDNAKit(OMEGA)，MagicMagGenomicDNAMicroKit(Sangon),TIANampMicroDNAKit(Tiangen)与本专利方法分别提取口腔上皮细胞DNA，对价格，操作时间，所提DNA总量，纯度(260/280，260/230)进行对比验证，所得数据如下表。本方法提取口腔上皮细胞基因组DNA质量的结果。使用本专利方法提取6个人的口腔上皮细胞DNA，并使用nanodrop检测所得到的数据如表1所示表1nanodrop检测所得到的数据样本编号DNA浓度(μg/ml)260/280260/230总体积(μl)177.752.031.95100287.112.062.23100369.802.082.09100485.002.042.42100593.382.032.07100695.062.072.02100口腔上皮细胞基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果。六人的基因组DNA均条带清晰，如图1所示。荧光定量PCR检验提取的DNA的下游实验可操作性。分别取每个人20ng的基因组DNA，随机选取一对引物(正向引物序列：5’-AGTGGATTCTCATTGCCTTCG-3’；反向引物序列：5’-ACCCTTTCTGCGCTTTGC-3’；探针序列：5’-CCAATCCCGCCATGCT-3’)，应用Taq-man探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法，其特征在于：步骤如下：⑴收集样品细胞用2个口腔拭子分别刮取口腔左右两侧的口腔上皮细胞，并把拭子头转移到2个含1ml去离子水的1.5ml的离心管中；震动离心管，使细胞从拭子上尽可能多的脱落，然后将2个含有口腔上皮细胞的1.5ml管离心，转速：800×g，时间：2分钟；吸弃上清液，每个EP管加入500μl的无菌水，将其中一个EP管的细胞转移到另一个EP管中，离心，转速：800×g，时间：2分钟；⑵裂解细胞吸弃上清液，向每管中加入500μl的溶液A，溶液A含9.5mmol/L的Tris‑Cl，2mmol/L的EDTA，1％的SDS，3％的Triton‑100，pH＝8.5，加后加入50μl浓度为1mg/ml的蛋白酶K溶液，涡旋振荡10秒钟，放入55℃水浴内15分钟；每5分钟振荡一次；⑶去除蛋白短暂离心，将管壁上的残留液体离至管底；加入200μl的醋酸钠‑冰醋酸溶液，剧烈振荡20秒钟，管中出现白色絮状物；12000×g离心3分钟，使白色物质沉淀到离心管底部；⑷沉淀DNA吸取400‑500μl的上清液到新的EP管中，加入800μl溶液B，溶液B组成为无水乙醇：异丙醇＝1:3，振荡10秒钟，使上清液与异丙醇充分混合；12000×g离心3分钟；⑸乙醇洗涤吸弃上清，加入800μl的75％乙醇，振荡5秒钟，12000×g离心2分钟；吸弃上清，重复上述步骤一次；⑹溶解DNA小心吸弃上清，室温下敞口干燥10分钟；将DNA溶解到100μl的无菌水中；⑺保存DNA将DNA样品做好标记，放于指定位置‑20℃或‑80℃中保存。...

【技术特征摘要】
1.一种专门用于快速大量提取口腔上皮细胞DNA的方法，其特征在于：步骤如下：⑴收集样品细胞用2个口腔拭子分别刮取口腔左右两侧的口腔上皮细胞，并把拭子头转移到2个含1ml去离子水的1.5ml的离心管中；震动离心管，使细胞从拭子上尽可能多的脱落，然后将2个含有口腔上皮细胞的1.5ml管离心，转速：800×g，时间：2分钟；吸弃上清液，每个EP管加入500μl的无菌水，将其中一个EP管的细胞转移到另一个EP管中，离心，转速：800×g，时间：2分钟；⑵裂解细胞吸弃上清液，向每管中加入500μl的溶液A，溶液A含9.5mmol/L的Tris-Cl，2mmol/L的EDTA，1％的SDS，3％的Triton-100，pH＝8.5，加后加入50μl浓度为1mg/ml的蛋白酶K溶液，涡旋振荡10秒钟，放入55℃水浴内15分钟；每5分钟振荡一次；⑶去除蛋白短...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙麟，马洁，张同，
申请(专利权)人：天津市康婷生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12