一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法技术

本发明专利技术一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，所述的提取方法为：S1、浓缩，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，弃上清；S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并高温孵育；S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸。本法提取的DNA样品，具有高得率、高纯度，可适用于荧光定量PCR等对模板要求较高的检测，增加了后续样本检测通用性。

A method of extracting free nucleic acid from large volume of cell free body fluid

Method of free nucleic acid extraction of the invention from a large volume of cell free fluid extraction method, the: S1, concentration, precipitant and buffer is added in the cell free fluid, vortex mixing at room temperature, the cell supernatant fluids were centrifuged; S2, cracking, adding sterilization the water obtained in step S1 precipitate, reversed mixing, the centrifuged and the supernatant; after adding lysis solution and K protein, resuspending the sediment and high temperature incubation; S3, purification, in step S2 to get the suspension adding isopropanol solution, after mixing with the combination of adsorption column or beads, followed by several times of sample cleaning lotion, finally to elute free high purity nucleic acid with eluent. The DNA sample extracted by this method has high yield and high purity. It can be applied to fluorescent quantitative PCR and other requirements for high template detection, which increases the universality of subsequent sample detection.

【技术实现步骤摘要】
一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法
本专利技术涉及核酸DNA的提取技术行业，尤其是涉及一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法。
技术介绍
循环核酸是一种细胞外游离状态的核酸，在人体血浆／血清中存在循环DNA、RNA和微RNA，这些核酸分子是在细胞凋亡或死亡后释放到外周血中，具有片段小和含量低的特点。许多疾病状态下，比如中风、心肌梗塞、糖尿病及许多恶性肿瘤患者血浆游离gDNA会显著升高。肿瘤患者体内循环肿瘤DNA（ctDNA）直接来自肿瘤细胞，对其进行基因分析可以获得肿瘤恶性程度的全部信息，可以为临床上肿瘤的早期诊断与鉴别、预后判断及疗效观察提供重要依据。孕妇外周血循环中存在胎儿游离DNA（cffDNA），开启了基于cffDNA的无创产前检测（NIPT）的新思路，尤其适用于高风险孕妇人群，因此血浆游离gDNA分析还可以作为产前诊断的重要方法。由于循环核酸具有含量低，片段小等特点，在提取过程中容易丢失，需具有较高灵敏度与得率的提取方法才能应用于定量和相关检测。cfDNA（血液中游离的DNA片段）存在血浆/血清中，在从血浆/血清中提取cfDNA之前，通常需要从（抗）凝血中通过低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的提取方法为：S1、浓缩 ，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，弃上清；S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并高温孵育；S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸。

【技术特征摘要】
1.一种从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的提取方法为：S1、浓缩，在无细胞体液中加入沉淀剂以及缓冲液，涡旋混匀后室温放置，对无细胞体液进行离心，弃上清；S2、裂解，在步骤S1中得到的沉淀物中加入灭菌水，颠倒混匀，对其进行离心处理，弃上清；之后，加入裂解液与蛋白K，重悬沉淀物并高温孵育；S3、纯化，在步骤S2中得到的悬液中加入异丙醇，混匀后使其与吸附柱或者磁珠结合，之后通过洗液多次对样品进行清洗，最后用洗脱液洗脱得到高纯度的游离核酸。2.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S1中沉淀剂为二价阳离子试剂，所述的沉淀剂的浓度为0.1M～1M。3.根据权利要求2所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的二价阳离子试剂为钙离子试剂、铜离子试剂、镁离子试剂以及二价铁离子试剂中的一种。4.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的离心速度为5000r/min～10000r/min，离心时间为1min～10min。5.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的裂解液的主要成分为盐酸胍、Tween-20以及TritonX-100，其浓度盐酸胍为0.5M～5M，Tween-20的浓度为1%～15%，TritonX-100的浓度为0.2%～5%。6.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的蛋白酶K的浓度为1mg/ml～5mg/ml。7.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述的步骤S2中高温孵育的温度为50℃～80℃，孵育的时间为5min～30min。8.根据权利要求1所述的从大体积无细胞体液中提取游离核酸的方法，其特征在于，在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶品彬，李娜，张佩琢，
申请(专利权)人：苏州吉玛基因股份有限公司，上海吉玛制药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32