一种α地中海贫血大片段基因缺失的修复方法技术

本发明专利技术公开了一种α地中海贫血大片段基因缺失的修复方法，属于生物基因工程领域；本发明专利技术方法利用CRISPR/Cas9技术成功在重型α‑地贫Bart's患者来源的iPSCs的γ‑珠蛋白基因位点中置入了HBA2基因，将γ‑珠蛋白基因替换成α‑珠蛋白基因，恢复了重型α‑地贫Bart's患者来源iPSCs的α‑珠蛋白表达，显著缓解了α‑/β‑珠蛋白肽链比例失衡程度，为有效治疗重型α‑地贫Bart's患者提供了新的治疗方向和思路；该修复方法通过在γ‑珠蛋白基因位点中置入了HBA2基因来实现重型α‑地贫细胞对HBA2基因的表达，能够用于修复α地中海贫血大片段基因缺失的缺陷，实现对重型α‑地贫的有效治疗，有利于为患者提供更有效、更安全的治疗方案。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因工程，主要涉及基因修复，具体涉及一种α地中海贫血大片段基因缺失的修复方法。

技术介绍

1、α-地中海贫血(α-地贫)是一种由α-珠蛋白基因缺失或功能缺陷导致的溶血性贫血病。其致病机制在于α-珠蛋白合成障碍，在中国南方地区尤为常见，携带率约为5％-15％，现已成为全国性的公共卫生问题。疾病的严重程度通常与α-珠蛋白基因拷贝数以及α-/β-珠蛋白肽链比例失衡程度有关。具体来说，人类16号染色体上包含着4个α-珠蛋白基因，该基因缺失的数量决定了地贫的类型：1个基因缺失为静止型，2个基因缺失为轻型，患者一般无症状，无需特殊治疗；3个基因缺失则导致中间型α-地贫(hbh病)，少数病例表型严重，出现胎儿水肿综合征或出生后需要定期输血以维持生命；4个α-珠蛋白基因全部缺失会引起重型α-地贫，即bart's水肿胎，导致α-珠蛋白肽链无法合成，使得多余的γ-肽链过度沉积聚合形成四聚体(γ4)，由于其对氧气亲和力高，造成胎儿组织严重缺氧。同时，四聚体γ4不稳定，易解离成游离的γ-肽链，这些肽链被氧化后沉积在红细胞膜上，加速红细胞破坏，进一步加剧缺氧症状。本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种α地中海贫血大片段基因缺失的修复方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于，在步骤(1)中，过分子克隆技术将靶向基因连接到PX458质粒上的具体方法为：利用BbsI酶对PX458质粒进行酶切处理后，再利用DNA连接酶将靶向基因与酶切处理后的PX458质粒进行连接，即得到PX458-HBG2-sgRNA质粒。

3.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述靶向基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1：CTTGTCAAGGCTATTGGTCA；所述第一正向引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:2：CACCG...

【技术特征摘要】

1.一种α地中海贫血大片段基因缺失的修复方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于，在步骤(1)中，过分子克隆技术将靶向基因连接到px458质粒上的具体方法为：利用bbsi酶对px458质粒进行酶切处理后，再利用dna连接酶将靶向基因与酶切处理后的px458质粒进行连接，即得到px458-hbg2-sgrna质粒。

3.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述靶向基因的核苷酸序列为seq id no:1：cttgtcaaggctattggtca；所述第一正向引物的核苷酸序列为seq idno:2：caccgcttgtcaaggctattggtca；所述第一反向引物的核苷酸序列为seq id no:3：aaactgaccaatagccttgacaagc。

4.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于，在步骤(1)中，通过分子克隆技术将模版基因连接到puc19质粒上的具体方法为：利用dna内切酶对puc19质粒进行酶切处理后，再利用dna连接酶将模版基因与酶切处理后的puc19质粒进行连接，即得到dsdna质粒。

5.根据权利要求1所述的修复方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨影虹，朱丽芬，孙筱放，谢英俊，陈狄禹，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心，广州柔济医院，
类型：发明
国别省市：