适于NSO细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基制造技术

本发明专利技术适于ＮＳＯ细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基为一种化学成分明确的无蛋白培养基，其组合物中包括２１种氨基酸、１３种维生素、８种盐类、４种脂类、６种微量元素，以及孕酮、碳酸氢钠、Ｈｅｐｅｓ、葡萄糖、柠檬酸、牛磺酸、胸苷、腺嘌呤、次黄嘌呤、酚红、巯基乙醇、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８；本发明专利技术的积极效果是：无需适应即可支持ＮＳＯ细胞的长期传代培养，能良好地支持ＮＳＯ细胞的正常生长及抗体表达；不含蛋白、各种水解物及动物来源成分，化学成分明确，有利于产物的分离纯化，提高医药生物制品的品质；配制方便，适合大规模生产应用。

【技术实现步骤摘要】
适于NS0细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基
本专利技术涉及现代生物技术之培养基研发
，具体地说，是一种适 于NS0细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基。技术背景现代生物技术是21世纪重点发展的前沿技术之一。其中，利用动物细胞 培养技术生产具有重要医用价值的生长因子、疫苗和单抗等已成为医药生物 高技术产业的重要组成部分。为完善动物细胞培养技术，人们非常关注对培 养动物细胞的培养基的研究，因为，培养基是动物细胞培养技术的基础和关 键要素之一。在过去几十年里，随着科学技术的发展，动物细胞培养经历了 采用有血清培养基、无血清培养基和无蛋白培养基的几个阶段。动物细胞培养是生产基因工程产品中的重要环节，研究发现，采用含有血清的细胞培养基会给生产及科研带来许多不利因素第一，影响细胞生长 及产品质量，存在批间差异；第二，易被支原体和病毒污染；第三，成分复 杂且不确定，给产物的分离纯化带来极大的困难；第四，血清的价格非常昂 贵，其费用通常占到培养基整体费用的50%以上，致使生产成本大幅度提高。 因此，血清在动物细胞大规模培养中的使用己受到了限制。二十世纪50年代初，人们开始了对无血清培养基的研究；80年代后，无 血清培养基的研究取得了迅速的发展，多种能支持不同种类细胞生长的无血 清培养基见诸报端；80年代末90年代初，具有商业应用价值的无血清培养基 纷纷上市，其中有Darfler等人开发的CITTL无血清培养基(以DMEM/F12 (1:1)为基础培养 基，添加了 5mg/L的过氧化氢酶、1.5mg/L的胰岛素、1. 5 3. 0mg/L的转铁 蛋白、2nmol/L睾酮、0. 5mg/L的二亚油酰磷脂胆碱和1. 5mg/L的e -甘油磷 酸)，该无血清培养基可支持s49细胞的生长，也可用于杂交瘤细胞的培养。 Chang等人(19S0)用所报道的无血清培养基成功地培养了几株杂交瘤细胞。Murakami等人开发的无血清培养基〔以DMEM/F12 (1:1)为基础，添加了 5mg/L胰岛素、2 35mg/L转铁蛋白、20陶ol/L乙醇胺和lnmol/L亚硒酸钠等 物质)，这就是现在被广泛使用的DMEM/F12-ITES配方。Kover和Frank开发的无血清培养基〔以RPMI 1640为基础培养基，并添 加了 10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20Wnol/L乙醇胺、5mg/L亚油酸、lg/L 牛血清蛋白、3mg/L抗坏血酸、2Pg氢化可的松和12种微量元素〕，这一培养 基适合几种细胞的生长。但是，研究中发现，无血清培养基中添加的蛋白成分价格太贵，且有的 成分，如牛血清蛋白，含有很多种杂质，给后期的分离纯化带来较大困难， 而且目前的新药审批对此方面的要求也越来越严格。因此，在商用无血清培 养基之后，科学家们又开始了对无蛋白培养基的研究，从动物细胞的培养基 中去掉蛋白成分。在对细胞营养需求研究的基础上，美国专利5， 045， 468公开了一种适合 杂交瘤细胞生长的无蛋白培养基，该培养基通过添加亚硝基铁氰化物、EDTA、 二氧化硒或亚硒酸钠等化合物有效取代了培养基中的蛋白成分。美国专利 5，804，420公开了一种适合B服细胞表达重组因子Vin的无蛋白培养基，其 中添加了嵌段式聚醚F68 (PluronicF-68)、硫酸铜、硫酸亚铁、EDTA、锰、 钼、硅、锂、铬等成分。另有报道，Jinyou Zhang等人成功地开发了一种适 合NSO细胞生长的无蛋白培养基，但由于其成分复杂、还包含了一种价格昂 贵、且化学成分未明确的商业混合脂，因此，不适用NSO细胞的大规模培养 及抗体生产。目前，在无蛋白培养基
，以Gibco、 Hyclone、 JRH等为代表的 商业无血清、无蛋白培养基己相继问世，近年来众多研究所报道的培养基大 多采用这些商业无蛋白培养基，它们对某些细胞株具有良好的效果；但是， 它们同样也存在一些明显的缺点，将其用于某些研究和大规模细胞培养与抗 体生产过程会有不少困难，其主要问题是第一，价格昂贵，只适合一部分 实验室小规模研究，不适合大规模细胞培养及抗体生产；第二，大多成分复 杂，并且添加了不确定的化学成分，给科研和生产过程带来困难；第三，有些培养基虽能很好地支持细胞生长，但却使细胞表达产物的能力降低，甚至 丧失。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适于NS0细胞大规模 培养及抗体生产的无蛋白培养基，以适应NS0细胞大规模悬浮培养及抗体生 产产业化的需要。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为采用氨基酸、维生素、盐类、脂类和小分子激素等物质代替传统无血清 培养基中的蛋白质和水解物，采用锌离子、EDTA、铁离子和柠檬酸等代替传 统无血清培养基中的胰岛素、转铁蛋白和白蛋白，开发出一种适于NS0细胞 大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基。一种适于NS0细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基，包括氨基酸、 维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂及葡萄糖、柠檬酸、牛磺酸、 胸苷、腺嘌呤、次黄嘌吟、酚红、巯基乙醇、Pluronic F-68，不含蛋白质及 水解物的组合物。所述的氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱 氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、 甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。所述的维生素为生物素、维生素B12、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、 泛酸钙、维生素B6、核黄素、维生素B1、腐胺、维生素C、维生素E。所述的盐类为氯化钙、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、'磷酸氢二钠、氯化钠、 磷酸二氢钠、丙酮酸钠。所述的脂类为胆固醇、硫辛酸、亚油酸、乙醇胺。所述的微量元素为硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、硝酸铁、亚硒酸钠、 EDTA. 2Na。所述的激素为孕酮。 所述的缓冲剂为碳酸氢钠和H印es。 所述无蛋白培养基中各种成分的含量为(mg/L)g (L_Alanine) g (L-Arginine HCI) 天冬酰胺(L-Asparagine.H20) 天冬氨酸(L-Aspartic Acid) 半胱氨酸(L-Cysteine. HCI.H20) 胱氨酸(L-Cystine.2HCI) 谷氨酸a-Glutamic Acid Sodium) 谷胺酰胺(L-Glutamine) 甘氨酸(Glycine) 组氨酸(L-Histidine.HCI. H20) 异亮氨酸(X-lsoleucine) 亮氨酸(L -Leucine) 赖氨酸(L-Lysine.HCI) 甲硫L氨酸(L-Methionine) 苯丙氨酸(X-Phenylalanine 脯氨酸a-Proline) 丝氨酸(L-Serine) 苏氨酸(L-Threonine) 色氨酸(L-Tryptophan) 酪氨酸(L-Tyrosine. 2Na. 2H20) '缬氨酸(L-Valine) 葡萄糖(D-Glucose) 生物素(Biotin) 维生素B12 (B12Cobalamin) 氯化胆碱(Choline Chloride) 叶酸(Folic Acid) 肌醇(I-inositol) 烟酰胺(Niacinamide)80. 5 104. 45 28本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适于ＮＳＯ细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基，其特征在于，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂及葡萄糖、柠檬酸、牛磺酸、胸苷、腺嘌呤、次黄嘌呤、酚红、巯基乙醇、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：牛红星，赵亮，范里，周燕，谭文松，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]