木脂素羟化酶制造技术

本发明专利技术提供具有木脂素羟基化活性的酶，特别是提供催化向木脂素类引入羟基的反应的酶，优选催化由胡椒醇向９－羟基胡椒醇、由松脂醇向９－羟基松脂醇进行的羟基化反应的酶。本发明专利技术涉及具有木脂素羟基化活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体或转化体、使用该转化体制造具有木脂素羟基化活性的多肽的方法等。使本发明专利技术所涉及的多核苷酸可表达地导入的转化体，在食品领域、各种工业领域中，在木脂素羟基化或生产利用该木脂素羟基化的产品上有用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及对木脂素具有引入羟基的活性的酶、及利用该酶的方法。
技术介绍
木脂素是维管束植物的次级代谢产物[例如，芝麻素及芝麻林酚(sesamolin)等]，在植物中广泛分布。到目前为止，己报道木脂素含有于 植物的种子、果实、切穗、块茎及/或块根等中，主要对植物中的生物体防 御体系起作用。此木脂素，因具有强力的抗氧化性等，所以，在植物以外的 很大范围内也具有生理学及药理学功能这一点很受关注。木脂素具有如卜结 构，其为具有"-C3骨架的苯丙素类化合物进行2分子聚合的结构，8， 8'键 合型最为普遍。代表性的木脂素，可例举芝麻(Sesamum indicum)中含有的(+ ) — 松脂醇、(+ ) —芝麻素、(+ ) —芝麻素酚(sesaminol) 、 ( + ) —芝麻 林酚(sesamolin)及(+ ) —芝麻酚林酚(sesamolinol);连翘(Forsythia intermedia)中含有的(+ )—松脂醇、(_)—牛蒡子苷元(arctigenin) 及(一) 一罗汉松脂素(matairesinol);唐古特瑞香(Daphne tangutica) 中含有的(一)一松脂醇及(一)一落叶松脂素；亚麻(Linum usitatissimum) 中含有的(+ ) —开环异落叶松脂素(Secoisolariciresinol)等。上述木脂素的分子结构多种 多样，从骨架结构上按8种亚类(sub class)分类。木脂素的生物合成途径以胡麻科芝麻、木樨科连翘、亚麻科亚麻为屮心 进行，已报道了一些催化代谢途径的酶及基因。其中，报道了松脂醇是通过 松柏醇聚合而合成的生物合成上最初的木脂素，且由(+ ) —松脂醇经过各6种植物种中特有的生物合成途径合成多种多样的木脂素[参考J. Wood. Sci. 53， 273-284 (2007) 、 Lig腿s :biosynthesis and function, Comprehensive natural products chemistry, (1999) 1:640-713]。 另夕卜， 通过胡椒醇合成酶对(+ ) —松脂醇作用而合成胡椒醇。松脂醇是木脂素生 物合成途径中最初合成的木脂素，所以，是分布于许多植物中的主要的木脂 素，例如，含有于菊科、木樨科、夹竹桃科、伞形花科、瑞香科、木兰科、 百合科、松科植物中。参与木脂素生物合成的酶，已报道有对连翘(Forsythia intermedia) 等中松脂醇的合成起作用的dirigent蛋白质(排列蛋白质)。此外，参与木脂素生物合成的酶的基因及其利用，已报道冇连翘的 松脂醇一落叶松脂素还原酶基因、西部红柏(Thuja plicata)的松脂醇一落叶松 脂素还原酶基因(参考非专利文献8)以及重组开环异落叶松脂素脱氢酶及 其使用方法。且还报道了芝麻中的具有胡椒醇-芝麻素合成活性的细胞色素P450酶基因以及使用方法。已知木脂素骨架形成后受到糖苷化、羟基化、甲基化、异戊二烯化等多 种多样的修饰，己报道对于作为芝麻木脂素的芝麻素酚(sesaminol)等的呋 喃骈呋喃型木脂素具有糖苷化活性的糖苷酶基因己被分离，还报道/K使川 方法(参考专利文献l:日本特开2006 — 129728公报)。已知原产中国的菊科橐吾属干崖子橐吾(Ligularia kanaitizensis)、 夹竹桃科黄蝉属黄蝉(Allamanda neriifolia)中，存在以松脂醇为代表的 呋喃骈呋喃型木脂素的9位的羟基化衍生物。已报道了 97位的羟基化衍生物9一羟基松脂醇通过体内(in vivo)试验而证明的抗氧化活性、丁酰胆碱酯酶抑制活性、还有最近研究出的对氧化损伤的神经细胞的保护作用。此外，还报道了在羟基被进一步修饰而成为酯基的2—甲基一2 — 丁烯酸一松脂醇中，具有抗HIV-1反转录酶(RT)活性，其生物合成途径还 有待阐明。如上所述，尽管报道了具有羟基的木脂素的有用性，但作为木脂素的羟 化酶，至今为止也只知道从蒺藜科Chaparral中分离的(+ ) —Larreatricin 羟化酶(参考非专利文献7: Proc. Nat. Acad. Sci.USA， (2006) 100:10641)。 此酶属于植物氧化酶的一种的多酚氧化酶(PP0)家族。此外，还已知除本酶家族以外， 细胞色素P450酶、2-酮戊二酸依赖型加氧酶等的氧化酶家族也催化木脂素的 羟基化反应(参考非专利文献9: De Montellano, P. R. 0. ， Cytochrome P450-structure, mechanisum， and biochemistry. 3rd edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, NY. (2005)及非专利文献10: J. Biol. Chem.(2004) 279,1206)。但是，(+ ) 一Larreatricin羟化酶是呋喃环9 (9，)位上没有氧的木脂素的羟化酶，所以，对于催化以松脂醇为代表的呋喃骈呋 喃型木脂素的9位羟化酶依然不清楚。因此，更加希望获得木脂素羟化酶基因和进行功能分析。专利文献l日本特开2006-129728公报非专利文献l Lignans，D.C. Ayres and J. D. Loike (1990)非专利文献2 Phytochemistry, (1988) 27,575非专利文献3 Indian丄Chem. ，(1995) 34B， 975非专利文献4 J. Pharmacy and Pharmacology, (2005) 57,233.非专利文献5 Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences,(2005) 42，167;非专利文献6 J. Pharm. Pharmacol.,(2007) 59:521 非专利文献7 Proc. Nat. Acad. Sci.USA， (2006) 100:10641 非专利文献8 Trends in Plant Science, (2007) 12,29 非专禾U文献9 De Montellano， P. R. 0., Cytochrome P450-structure,mechanisum， and biochemistry. 3rd edition. Kluwer Academic/PlenumPublishers, NY. (2005)及非专利文献10丄Biol. Chem. (2004) 279， 1206.
技术实现思路
鉴于以上情况，本专利技术的目的在于提供具有木脂素羟基化活性的酶，特 别是提供催化向木脂素类中引入羟基的反应的醇，优选催化由胡椒醇向9一 羟基胡椒醇、由松脂醇向9一羟基松脂醇进行的羟基化反应的酶。换句话说， 本专利技术的目的在于，使用具有向木脂素(优选9位)引入羟基的活性的酶， 提供代谢工程学上的羟基化木脂素(优选9位被羟基化的木脂素；以下称9 一羟基化木脂素)。本专利技术的目的还在于，提供为高效生成木脂素或羟基化木脂素，用代谢 工程学的方法制作使木脂素和羟基化木脂素含量比增加或减本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽，其为具有木脂素羟基化活性的多肽，含有　（ａ）序列号：２６的氨基酸序列；　（ｂ）序列号：２６的氨基酸序列中，１～１５个氨基酸发生缺失、插入、取代及／或附加的氨基酸序列；或　（ｃ）与序列号：２６的氨基酸序列有至少８０％同 源性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：福井祐子，冈田亚砂子，小野荣一郎，
申请(专利权)人：三得利株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]