将核酸导入高等真核细胞内的结合体制造技术

将基因构建体转运到高等真核细胞内的结合体，其中病毒通过抗体结合到对核酸有亲和性的物质上。结合体与核酸的复合体在细胞中内在化，同时病毒作为复合体的一部分引起内在化并释放核内体的内容物，当复合体进入细胞后即定位于其中。在其特别适用于基因治疗的医学制剂中，核酸是治疗上有活性的基因构建体。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA
具体地说，本专利技术涉及将核酸导入高等真核细胞内的方法。在基因治疗中，需要建立一个将核酸导入活细胞内的有效系统。将基因导入细胞内是为了实现在体内合成治疗上有效的基因产物，例如在有遗传缺陷的情况下取代有缺陷的基因。“常规”基因治疗是基于用单一治疗方法达到持久治愈这一原则。但也需要这样的治疗方法，即一次性或必要时重复给予作为药物(“基因治疗剂”)的治疗上有效的DNA(或mRNA)。可进行基因治疗的遗传性疾病的例子有血友病、β-地中海贫血和“严重复合免疫缺陷症”(SCID)此乃为遗传性腺苷脱胺酶缺乏而引起的综合症。其他可能的应用是用于免疫调节，其中通过免疫接种注射编码分泌性蛋白质抗原或非分泌性蛋白质抗原的功能性核酸，以建立体液或细胞内免疫。可用编码有缺陷基因的核酸治疗的遗传缺陷还包括营养不良(营养障碍基因)、囊性纤维变性(囊性纤维变性跨膜电导调节基因)、高胆固醇血症(LDL受体基因)。当激素、生长因子或具有毒性或免疫调节活性的蛋白质需在体内被合成时，基因治疗方法也有很大应用价值。通过使用所谓的“肿瘤疫苗”进行基因治疗也可望用于治疗肿瘤。为了提高肿瘤细胞的免疫原性，可以对其进行改变以使之有更大抗原性或使之产生某些细胞活素，以激发免疫反应。为此，可用编码细胞活素如IL-2、IL-4、γ-IFN、α-TNF的DNA转染细胞。迄今为止，已通过还原病毒载体将基因转移到自体肿瘤细胞中。反义RNA和DNA以及核酶的活性特征能使之用作治疗剂，以阻断某些基因在体内的表达(如失调的癌基因或病毒基因)已有证据表明，短的反义寡核苷酸可进入细胞内并在其中发挥其抑制作用(Zamechiketal.，1986)，但由于核酸带有强负电荷使之难以通过细胞膜被细胞摄入，以致它们只有很低的细胞内浓度。虽然已有多种技术可在体外将基因转移到哺乳动物细胞内，但这些技术在体内应用时却受到了限制(这些技术包括借助脂质体、电击法、微量注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖或磷酸钙沉淀等方法导入DNA)。近年来，已发现了生物学载体，其亲代病毒的有效进入机制可引起基因转移。已将这一技术措施用于构建重组还原病毒和腺病毒载体，从而得以在体外和体内进行高效基因转化(Berkner，1988)。尽管它们很有效，但这些载体受到被转移之DNA的大小和构建的限制。此外，从其转移原始病毒之活病毒基因成分的角度来说，这些制剂是有一定危险性的。例如使用还原病毒时就存在着问题，因为它至少存在着较低频率地引起病毒感染(通过与内源病毒重组或可能继而突变成病原因子)或导致肿瘤生成的危险。再者，不可期望在每种情况下都借助还原病毒稳定地转化病人的体细胞，因为一旦出现有害影响，这只能使治疗更难以逆转。为了避免这些限制，已发展另外一些基于转移大分子所用细胞之机制的基因转移战略。其中一个例子是通过极为有效的受体介导的胞吞作用途径将基因转移到细胞中(WuandWu，1987，Wagneretal.，1990andEP-Al0388758)。该方法使用了具有DNA结合区和对细胞表面受体有特异性之区域的双功能分子结合体(WuandWu，1987，Wagneretal.，1990)。如果识别区(下称“内在化因子”)被细胞表面受体识别，结合体即可通过受体介导的胞吞途径内在化，其中结合在结合体上的DNA也得以转移。使用该方法可使基因转移率至少能与使用常规方法的转移率相同(Zenkeetal.，1990)。虽然该载体系统能够将大量DNA运输到具有适当细胞表面受体的细胞内，但相应的基因表达却常常不能与这一转移能力相适应(Cottenetal.，1990)。据推测，出现这种现象的原因可能是通过受体介导的胞吞作用转运到细胞内的DNA落入溶酶体内，致使DNA遭到降解(Zenkeetal.，1990;Cottenetal.，1990)。因此，进入溶酶体中的DNA没有任何特异性机制得以离开此细胞内囊泡系统，这一事实便构成了使用该转运系统时存在的固有限制。本专利技术的目的在于减小或消除这些限制。有许多病毒都能借助于一机制有效地进入真核宿主内，此机制则基本上都与上述受体介导的胞吞作用机制相当。基于这一机制的病毒感染一般都是随着病毒颗粒与细胞膜上的受体相结合而开始的。此后，病毒便进入细胞内。该内在化过程遵循一个与生理学配基或大分子进入细胞相对应的共同途径首先，细胞表面上的受体自身排列成组群，膜向内翻转形成一个由包层环绕的囊泡。然后囊泡本身脱离其笼形包被物，借助位于膜中的质子泵在其内部发生酸化。这一过程引起了病毒从核内体释放。根据病毒是否具有脂质衣壳，可将从核内体释放的病毒分为两个类型来考虑;在所谓“裸”病毒(如腺病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)的情况下，据称低pH可引起病毒蛋白质构型的改变。这样便使之暴露出在生理pH条件下不能接近的疏水区。因此这些区域便获得了与核内体膜相互作用的能力，从而导致病毒基因组从核内体释放到胞浆中。对于有外壳的病毒(如水泡性口炎病毒、SemlikiForest病毒、流感病毒)，则推测低pH可修饰某些病毒蛋白质的结构或构型，从而促进病毒外膜与核内体膜的融合。借助这一机制穿入细胞内的病毒具有某些分子特性，使之能够打破核内体膜，得以进入胞浆内。其他病毒，如有外壳包裹的仙台病毒、HIV及某些莫罗尼白血病病毒的毒株，或者无外壳的SV40和多形瘤病毒，穿入细胞时则不需要低pH;它们可以在细胞表面上直接与膜融合(仙台病毒，可能还有HIV)，或者能够启动破开细胞膜或穿过细胞膜的机制。据推测，不依赖于pH的病毒也能够使用胞吞途径(McClureetal.，1990)。在完成本专利技术前的实验中已证实，借助核酸复合体(其中核酸与多聚阳离子复合，也可偶联上内在化因子，如转铁蛋白-多聚赖氨酸结合体)进行基因转移时，可因用腺病毒、特异性还原病毒或用病毒片段处理而得以增强。这种效应是利用了下述现象而达到的;即这些病毒通过胞吞机制被摄入细胞内，而且还具有使之得以打开核内体以从囊泡系统中逃离的特异性机制，例如腺病毒(pastanetal.，1986)。从这些观察入手，通过发展含有病毒(作为其功能性构建体的整合部分)的生物接合体而解决了本专利技术的问题。本专利技术涉及新的结合体，该接合体具有与核酸形成复合物的能力，并含有内在化因子和对核酸有亲和性以将核酸导入高等真核细胞的物质，特征在于内在化因子可以是附着在由一抗体形成的对核酸有亲和性的物质上的病毒，以这种方式它本身能够作为结合体/核酸复合体的一部分穿入细胞内，并能释放出核内体的内容物，其中复合体在进入细胞后被定位在胞浆内。本专利技术还涉及包含核酸和本专利技术之结合体的复合体，其中所说的结合体包括内在化因子和对核酸有亲和性的物质。本专利技术还涉及用于转化很少或没有病毒受体之高等真核细胞的复合体，特征在于它们进一步包含了与对核酸有亲和性的物质结合之内在化因子的第二结合体，其中内在化因子是对高等真核细胞的表面受体特异的，且其中病毒结合体和内在化因子结合体是与核酸复合的。本专利技术还涉及将核酸导入高等真核细胞内的方法，特征在于用本文所述的本专利技术的核酸复合体之一处理细胞。本专利技术还涉及医药组合物，特征在于它们所含作为活性的成分是本专利技术的一种核酸复合体。附图说明图1图解显示含有腺病毒衣壳上外来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备能与核酸形成复合体并将所说的核酸导入高等真核细胞内的结合体的方法，所说的结合体包括内在化因子和对核酸有亲和性的物质，特征在于使作为内在化因子的病毒通过抗体结合到对核酸有亲和性之物质上，其中所说的病毒能够作为结合体／核酸复合体的一部分穿入细胞内并释放核内体的内容物至胞浆中，复合体进入细胞后位于核内体中。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：D克莱尔，平昌胡，E瓦格纳尔，ML伯恩斯太尔，M克顿，
申请(专利权)人：博灵格英格尔海姆国际股份公司，北卡罗来纳查珀尔希尔大学，
类型：发明
国别省市：DE[德国]