用于基因表达的核酸构建体制造技术

本发明专利技术提供了含有病毒基因组核酸的核酸构建体，其含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性。该内源基因表达调控单元用于表达所选的特定异源编码基因以及特别用于表达异源抗原。可将构建体用在疫苗中以产生对异源抗原的免疫应答以及特别可用于ＤＮＡ疫苗中。本发明专利技术还提供产生构建体的方法以及其施用方式。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和免疫学领域，并主要涉及基因表达的方法。更具体地，本专利技术涉及用于表达多肽的核酸构建体，以及它们在通过免疫尤其是通过核酸免疫而在受试者中激发免疫应答中的应用。
技术介绍
传统的接种疫苗策略通常包括施用“活的”或“死的”疫苗(Ertl等，(1996)J.Immunol.1563579～3582)。所谓的活疫苗包括减毒微生物和基于活载体的重组分子。死疫苗包括那些基于灭活的完整病原体和亚单位疫苗的疫苗，所述亚单位疫苗例如可溶性的病原体亚单位或蛋白质亚单位。活疫苗通常能在免疫个体中成功地提供有效的免疫应答；然而，这种疫苗在免疫缺乏的或怀孕的受试者中是危险的，其可能回复为致病性有机体，或可能被其它的病原体污染(Hassett等，(1996)Trends inMicrobiol.8307～312)。死疫苗，如亚单位疫苗，避免了与活疫苗有关的安全问题。由于亚单位疫苗不含有完整病原体，所以它们通常能避免免疫调节性病毒蛋白的问题，所述免疫调节性病毒蛋白可从减毒病毒疫苗表达并能降低疫苗接种的效率。然而，死疫苗，尤其是亚单位疫苗，经常不能在免疫个体中提供合适的和/或有效的免疫应答。增强亚单位疫苗的效率的一个可能的方法是，使疫苗包含多个亚单位。用多个抗原进行免疫接种是理想的，因为该方法通常诱导更显著的免疫应答，其能提供比用单个抗原进行免疫接种更好的保护。多个亚单位疫苗也有助于减少鉴定能提供保护性应答的特定单个抗原的需要。这对于在远交群体中诱导细胞免疫应答尤其重要，远交群体中的个体对单个基因产物的应答差异很大，因此，没有一个抗原能在该整个群体中引起保护性的免疫应答。可通过很多途径将疫苗导入到待免疫的受试者中。最近，已经描述了通过肌肉内(Wolff等，(1990)Science 24714651468)或使用针和注射器的皮内注射(Raz等，(1994)PNAS USA 919519～9523)来直接注射质粒DNA。从而，编码抗原的构建体，而不是抗原本身，被导入到受试者中。这种包含编码抗原的核酸构建体的疫苗称作DNA疫苗。递送DNA疫苗的另一种方法称作弹道式或颗粒介导的DNA递送，其使用无针颗粒递送装置把DNA包被的微金珠直接施用到表皮细胞中(Yang等，(1990)PNAS USA 879568～9572)。因此，很多递送技术可用于递送免疫接种中使用的核酸，包括将核酸包被的微粒递送到靶组织中的颗粒介导的技术(参见，例如共同拥有的美国专利No.5,865,796，1999年2月2日出版)。使用DNA疫苗获得的有效保护水平，与传统蛋白质亚单位疫苗和灭活或减毒病毒疫苗激发的有效保护水平类似；尽管它通常比在自然感染恢复后的康复期动物中观察到的低(Manickan等，(1997)CriticalReview Immunol.17139～154)。颗粒介导的核酸免疫技术已经显示在表皮递送纳克量的DNA后，能激发体液和细胞毒性T淋巴细胞免疫应答(Pertmer等，(1995)Vaccine 131427～1430)。已将这种颗粒介导的递送技术与其它类型的核酸接种进行了比较，并发现了显著的优势。Fynan等，(1995)Iht.J.Immunopharmacology 1779～83，Fynan等，(1993)Proc.Natl.Acad.SCI.USA 9011478～11482，和Raz等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 919519～9523。
技术实现思路
本专利技术是基于以下事实病毒基因组中的基因群以使基因表达间的干扰最小化而使含有这些基因的区域的稳定性最大化的方式共同进化。病毒基因的这种协同进化可用于产生用于异源编码序列共表达的表达构建体。因此，获取包含两个或多个这种病毒基因的基因组核酸区域，而且用待表达的异源编码序列取代病毒基因的天然编码序列。因此，构建体受益于使用的病毒启动子与其它调控元件的相容性，并因此显示增强的稳定性和最小的干扰。然后可以引入对基因组核酸的进一步改变以使构建体最佳化。因此，本专利技术提供了能表达多个异源编码序列的构建体。使用单个构建体来表达几个异源多肽，而不是从单独的构建体来表达每个异源多肽，能降低制备和质量控制的复杂性。它还可能降低获得调控认可的难度。由于使用了病毒基因组核酸的内源基因表达调控单元，所以增加了该构建体的稳定性并降低了干扰，这与把带有它们自身的启动子或通常用于获得高水平表达的其它启动子的多个基因插入到载体中而构建的构建体明显不同，因为后者所述的构建体常显示不稳定性以及启动子间的干扰。因此，本专利技术提供了含有病毒基因组核酸的核酸构建体，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性，其中(a)至少两个含有在相同阶段具有活性的启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的分离的异源编码序列上；而且(b)除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。本专利技术还提供了产生核酸构建体的方法，该核酸构建体用于直接施用于受试者以在受试者中激发免疫应答，所述方法包括(a)将病毒基因组核酸插入到载体骨架中，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性；而且(b)在将病毒基因组核酸插入到载体骨架中之前、同时或之后，将病毒基因组核酸中的至少两个内源基因表达调控单元的内源启动子可操作地连接到异源编码序列上。其中，除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。本专利技术还提供了适于由颗粒介导的递送装置进行递送的包被的颗粒，该颗粒包含由核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体包含病毒基因组核酸，该病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中(a)至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且(b)除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。本专利技术还提供-一种用于颗粒介导的递送装置的剂量容器，该剂量容器包含本专利技术的包被的颗粒；和-一种颗粒介导的递送装置，该颗粒介导的递送装置装载有本专利技术的包被的颗粒。在另一个实施方案中，本专利技术还提供了感兴趣的多肽在哺乳动物细胞中获得表达的方法，该方法包括将含有病毒基因组核酸的核酸构建体转移到所述细胞中，所述的病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒周期中的相同阶段具有活性，其中-至少两个含有启动子的内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的异源编码序列上；而且-除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为1kb到50kb。在另一个实施方案中，本专利技术提供了一种核酸免疫的方法，该方本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有病毒基因组核酸的核酸构建体，所述病毒基因组核酸含有至少两个内源基因表达调控单元，每个该内源基因表达调控单元均包含内源启动子，其中该单元的内源启动子在病毒基因组核酸来源病毒的病毒生活周期中的相同阶段具有活性，其中：（ａ）含有在相同阶段有活性的启动子的至少两个内源基因表达调控单元中的每个均可操作地连接于插入到病毒基因组核酸中的分离的异源编码序列上；和（ｂ）除了插入到其中的异源序列外，病毒基因组核酸的长度为１ｋｂ到５０ｋｂ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：拉尔夫帕特里克布朗，
申请(专利权)人：磨粉机械研究有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]