用于向组织中体内进行核酸载体最佳电转移的装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及使用弱电场提高转移效率而使核酸载体向细胞、尤其肌细胞和肿瘤细胞内体内转移显著增强的系统和装置。本发明专利技术的装置用来提供一种最佳电压梯度，来增强核酸载体向细胞内的迁移，而不损伤细胞或组织。这些装置的特征在于独特的电极排列，和最大电压设置所限定的独特功率极限。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用弱电场提高转移效率而使核酸载体向细胞内、尤其肌细胞内体内转移的显著增强。本专利技术尤其涉及为了基因治疗实现这种核酸载体转移的方法、装置和组合物。本专利技术的装置用来提供一种最佳电压梯度，以增强核酸载体向细胞内的迁移，而不损伤细胞或组织。这些装置的特征在于独特的电极排列，和最大电压设置所限定的独特功率极限。
技术介绍
用于基因输送的载体与方法基因向特定细胞中的转移是基因治疗的基础。然而，一个问题是向待处理的宿主细胞中引入足量的核酸。目的基因必须在转染的细胞中表达。在此方面采用的一种方法是核酸在病毒载体中、尤其在反转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒中的整合。这些系统利用病毒发展的细胞侵入机制，以及对抗降解的保护。然而，该方法也存在问题。一是产生易于在宿主生物中传播的传染性病毒颗粒的危险，以及对于反转录病毒载体而言，插入诱变的危险。此外，治疗性基因或疫苗基因在病毒基因组中的插入能力仍然是有限的。最后，常常产生针对病毒载体的免疫应答，这由于免疫清除而使病毒的再施用无效，并且也可引起炎症。另一种方法(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990；Davis等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，7213-18，1996；Felgner等人的美国专利号5,580,859)包括向肌肉或血流中施用一种质粒型核酸，无论其是否与利于其转染的化合物连接，如蛋白质、脂质体、荷电脂或阳离子多聚体如聚乙烯亚胺，它们是很好的体外转染剂(Behr等人，美国国家科学院院报86，6982-6，1989；Felgner等人，美国国家科学院院报84，7413-7，1987；Boussif等人，美国国家科学院院报92，7297-301，1995；美国专利5,676,954和欧洲专利425475)。关于肌肉，由于Wolff等人的最初发表内容，见上文，显示肌肉组织中摄入以游离质粒形式注射的DNA的能力，所以许多研究者设法改进该方法(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗(Human Gene Ther.)4，419-431；Wolff等人，1991，生物技术(BioTechniques)11，474-485)。从这些试验中已显现某些趋势，特别是·机械手段的应用，其通过将DNA吸附于球上然后推射至组织(“基因枪”)使DNA进入细胞内(Sanders Williams等人，1991，美国国家科学院院报88，2726-2730；Fynan等人，1993，生物技术11，474-485)。已证明这些方法在接种策略中是有效的，但只接触表面组织层。对于肌肉而言，其应用需要外科方法来提供与肌肉的接近，因为颗粒不能穿过皮肤组织；·DNA的注射，其不再为游离质粒形式，但与能用作载体的分子连接，以利于复合物进入细胞。在其它许多转染方法中使用的阳离子脂迄今为止已清楚在对肌肉的应用中是令人失望的，因为那些已试验的脂证明抑制转染(Schwartz等人，1996，基因治疗(Gene Ther.)405-411)。对于阳离子肽和多聚体同样如此(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431)。有利组合的唯一例子似乎是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮与DNA的混合物。这些组合产生的增强相对于裸DNA注射只达到10倍以下(Mumper等人，1996，药物研究(Pharmaceutical Research)13，701-709)；·对注射溶液的组织的预处理，试图增强DNA扩散和/或稳定性(Davis等人，1993，人类基因治疗4，151-159)或促进核酸的进入，例如，细胞增殖或再生现象的诱导。该处理尤其涉及局部麻醉剂或心脏毒素、血管收缩剂、内毒素或其它分子的应用(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431；Danko等人，1994，基因治疗1，114-121；Vitadello等人，1994，人类基因治疗5，11-18)。这些预处理方案难以控制。尤其是丁哌卡因，为了有效必须以非常接近致死剂量的浓度使用。试图增强扩散的高渗蔗糖的预注射不能提高肌肉中的转染水平(Davis等人，1993)。已通过单独使用质粒DNA或通过与合成载体连接体内转染了其它组织(Cotten和Wagner的综述(1994)，生物技术的当前观点(Current Opinionin Biotechnology)4，705；Gao和Huang(1995)，基因治疗，2，710；Ledley(1995)，人类基因治疗6，1129)。研究的主要组织是肝脏、呼吸道上皮、血管壁、中枢神经系统和肿瘤。在所有这些组织中，证实转基因表达水平太低以至于不能预见治疗性应用(例如，对于肝脏，见Chao等人(1996)，人类基因治疗7，901)，尽管最近对于血管壁中的质粒DNA转移有一些令人鼓舞的结果(Iires等人(1996)，人类基因治疗7，959和989)。在脑中转移效率很低，如同在肿瘤中一样(Schwartz等人，1996，基因治疗3，405；Lu等人，1994，癌症基因治疗(Cancer Gene Therapy)1，245；Son等人，美国国家科学院院报91，12669)。用于基因输送的电穿孔和离子电渗疗法电穿孔，或者用来透化细胞的电场的应用，通常在体外使用以促进培养细胞中的DNA转染。该现象依赖于达到阈电场强度。对于动物细胞，在大约800-1200伏特/cm的相对高强度的电场下观察到电透化作用。也建议在体内进行该技术，以便增强抗肿瘤剂如博来霉素在人实体瘤中的效能(美国专利号5,468,228，L.M.Mir)。应用极短持续时间(100微秒)的脉冲，这些电条件(800-1200伏特/cm)很好地适用于小分子的细胞内转移。应用这些条件(100微秒的脉冲)不引起核酸向肝脏中体内转移的增强，与无电脉冲时的DNA注射相比，证明低于1000伏特/cm的电场完全无效甚至是抑制性的(专利WO 97/07826和Heller等人，FEBS Letters，389，225-8，1996)。此外，对于体内应用，该技术存在困难，因为如此强度的电场的使用能引起广泛的组织损伤。靶组织的损伤在癌症患者肿瘤治疗中不是一个问题，但当向非肿瘤组织的组织中、尤其是向横纹肌中施用核酸时就可能是一种主要缺点。有三种基本类型的系统用来在电穿孔和离子电渗疗法中施行电脉冲外部电极、内部电极(包括导管)和外部与内部电极的组合。外部电极在一类装置中，在患者外部放置电极。参见，例如，Hofmann的美国专利号5,318,514；Hofmann的5,439,440；Hofmann的5,462,520；Hofmann的5,464,386；Hofmann等人的5,688,233；和Weaver等人的5,019,034；其公开内容在此引入作为参考。应用一种外部电极装置，电极与患者的表面组织区相接触。该装置中电极的使用可以是患者皮肤上的非侵入性使用，或者通过对经外科暴露的器官表面侵入性地使用。Hofmann’514专利公开了一种装置，它用于向患者的预选的表面组织区内植入大分子如基因、DNA或药物。该装置具有一种头部组件，在第一种实施方案中，该组件包括位于开孔弹性体上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于向多细胞真核生物细胞中进行体内核酸转移的系统，其中通过直接向组织施用或通过局部或全身施用使组织细胞与待转移的核酸接触，并且通过对组织施加一次或多次强度为１－６００伏特／ｃｍ的电脉冲来确保转移，该装置包括：ａ）一种电脉冲发生器，其 中该电脉冲发生器产生脉冲时间长于１毫秒且强度为１－６００伏特／ｃｍ、频率为０．１－１０００Ｈｚ的电脉冲；和ｂ）与电脉冲发生器连接的电极，用来在与电极接触的组织中产生电场。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M布瑞奥，L密尔，D舍曼，B施瓦茨，
申请(专利权)人：阿文蒂斯药物股份有限公司，古斯达威罗斯研究所，国家科研中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]