棒酸生产的改进方法技术

本发明专利技术涉及一种利用带小棒链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的选择株和／或保藏株或其突变体经需氧发酵生产棒酸的方法。因此，为了在发酵过程中将滤过培养液中的蛋白质浓度控制于一定限度之内，通过连续或半连续补加一种或多种复合有机氮源优选地大豆粉进行培养。所述条件导致棒酸发酵的明显改进。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及应用带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)菌株、低价复合培养基和易于工业实施的策略对棒酸发酵的重要改进。医药中棒酸与可被β-内酰胺酶灭活的抗生素结合使用。作为β-内酰胺酶的强抑制剂，棒酸能避开这种抗性机制，而增宽数种抗生素的抗菌活性谱。当与抗生素如羟氨苄青霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、羧噻吩青霉素、苄青霉素或头孢噻啶结合时，棒酸显示抗产β-内酰胺酶生物的良好的协同活性。有几种微生物产生棒酸，即带小棒链霉菌、Streptomycesjumonjinensis(西班牙专利543 854)和桂滨链霉菌(Streptomyceskatsurahamanus)(日本专利53-104796,Takeda Chemical Industries,Ltd.)。对于带小棒链霉菌的棒酸生产，已描述了多种方法，例如(a)利用复合或化学成分确定培养基的不连续发酵(英国专利1 508 977,Beecham Group Ltd.)；(b)自动控制pH为6.3-6.7的发酵(英国专利1 571 888,Glaxo Laboratories Ltd.)；(c)连续或半连续补加碳源(例如麦芽糖或甘油)的发酵(西班牙专利537 157,Antibioticos,S.A.)；和(d)在发酵开始及整个过程中控制培养基中可溶性磷酸盐的发酵(欧洲专利0 811 689,Antibioticos,S.A.)。在使用可溶性培养基的带小棒链霉菌不连续发酵中，通常观察到棒酸效价的时程与干重浓度密切相关，直到达到最大值为止，随后两者都降低。干重浓度的降低可归因于孢子形成和/或菌丝体裂解。棒酸效价的降低可能是由于其降解速度高于其产生速度。专利技术详述本专利技术涉及一种利用发酵技术的棒酸生产方法，包括使用带小棒链霉菌的选择株和/或保藏株或其突变体的需氧浸没培养。因此，为了在发酵过程中将滤过培养液中的蛋白质浓度控制于一定限度之内，通过连续或半连续补加一种或多种复合有机氮源优选地大豆粉进行培养。本专利技术所述的条件成功地导致棒酸发酵的下列重要改进(a)棒酸产量明显提高；(b)防止发酵过程中菌丝体裂解；(c)发酵过程中棒酸效价与干重浓度的连续增加(不需部分排放发酵液)；和/或(d)棒酸效价连续增高，从某一时间点开始干重浓度保持基本恒定(部分排放发酵液)。因此，本专利技术描述了棒酸生产的新的方法策略，即在与迄今已获专利保护或报道的截然不同的条件下，在应用低价复合培养基的需氧浸没培养中，培养生产微生物(如带小棒链霉菌ATCC 27064或其突变体)，导致棒酸发酵的重要改进。这些条件在于连续或间隔地补加一种或多种复合有机氮源，以在发酵过程中将滤过培养液中的蛋白质浓度控制于一定限度之内，因为极高的浓度值可抑制/阻止抗生素的生物合成，而极低的浓度值可限制希望的生物合成。复合有机氮源可以是种子蛋白质如大豆粉、花生粉、棉籽粉和亚麻仁粉、鱼粉、这些蛋白质的水解产物和滤过物、肉膏和水解产物如蛋白胨，优选地大豆粉。以连续或半连续方式补加的复合有机氮源的量可以是0.1-1.5％，优选地0.18-1.0％的日浓度，和/或可以是使得发酵过程中滤过培养液中的蛋白质浓度为200-3500mg/L，优选地400-1500mg/L的量。根据该方法，初始培养基可由一种或多种复合有机氮源和另外的一种或多种碳源组成。复合有机氮源的浓度优选地是1.3-1.8％。碳源可以是甘油和/或碳水化合物如淀粉、淀粉水解产物、糊精和麦芽糖。观察到在初始培养基中优选地分别以0.9-1.3％和1.8-2.2％的浓度同时使用甘油和糊精可提高棒酸产量。另外，也可在发酵过程中以0.18％-1％的日浓度连续或半连续补加一种或多种碳源，和/或使滤过培养液中的甘油浓度为0.2-12g/L，和/或使滤过培养液中的糊精或麦芽糖浓度分别为4-22g/L或2-12g/L。观察到同时补加甘油和糊精或麦芽糖可提高棒酸产量。能通过连续或半连续部分排放发酵液进行发酵，这样使得发酵液体积保持为发酵罐总容量的35-65％。在发酵过程中可根据体积、培养液粘度和干重浓度的增加逐渐提高搅拌器速度，以提高培养物中混合及溶解氧的水平。培养可在26-29℃温度下进行，并可通过自动加入酸和碱(如盐酸溶液和氢氧化钠溶液)将pH控制为6.5-6.8。加入消泡剂如硅氧烷悬液可控制泡沫。发酵容器应当是具有搅拌和通气装置的典型需氧发酵罐。每单位培养液体积的通气体积流速可以是0.6-1.3vvm。这些罐应当具有用于连续或半连续补加几种溶液和/或悬液形式的养分的无菌系统，具有用于连续或半连续部分排放发酵液的无菌系统，并可能具有可变的搅拌器速度。为了进行该分析，优选地通过事先在烘箱中86℃干燥12小时的滤纸真空抽滤培养液样品。合并滤液后，用蒸馏水洗涤含有菌丝体的滤纸，随后在烘箱中86℃干燥24小时。从而获得样品的干重浓度。通过分光光度法，或优选地通过高压液相层析法，例如分别用(Bird,A.E.等人，1982，分析家(Analyst)107:1241-1245；Foulstone,M.和Reading,C.,1982，抗微生物剂化学疗法(Antimicrob.AgentsChemother.)22:753-762)、(Bradford,M.M.,1976，分析生物化学(Anal.Biochem.)72:248-254)、(Bok,S.H.和Demain,A.L.,1977,分析生物化学81:18-20)、(Nelson,N.,1944，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)153:375-380；Somogyi,M.,1952，生物化学杂志195:19-23)所述的方法，能测定滤液中棒酸、蛋白质、甘油、糊精或麦芽糖的浓度。通过下列不同的实施例展示了所获得结果的概况。实施例1从每升蒸馏水含10g水合糊精、1g酵母提取物、1g肉膏、2g细菌培养用蛋白胨、2g CaCO3、20g琼脂的琼脂斜面上制备带小棒链霉菌ATCC 27064的孢子悬液。用1M NaOH和1M HCl将pH校正为7.1。用该孢子悬液接种含50mL培养基A(每升蒸馏水15g大豆粉、10g(87％)甘油、10g水合糊精、1g KH2PO4)的不同500mL锥形瓶。用1M NaOH和1M HCl将pH校正为7.2。烧瓶于121℃灭菌15分钟，并在30℃和110-140转/分条件下培养2天。然后混合5个烧瓶的内容物，得到营养接种体。向8升STR发酵罐中分别加入3.1L由每升自来水含15g大豆粉、13g(87％)甘油、20g水合糊精、1g(50％)硅氧烷悬液组成的培养基B，在大约120℃下灭菌20分钟。用先前制备的营养接种体接种发酵罐。通过加入5％(v/v)HCl溶液和1M NaOH溶液自动控制pH为6.6±0.05，进行发酵。加入50％硅氧烷悬液控制泡沫。温度保持为26-29℃，通气为0.7-1.2vvm。在24小时时，用可变速度的蠕动泵开始间隔补加由每升自来水含65g大豆粉和100g(87％)甘油组成的培养基C。根据对滤过培养液中蛋白质和甘油浓度的日分析结果，手动控制体积流速。因此，在整个发酵过程中体积流速如下变化表Ⅰ 由于在整个发酵过程中体积、培养液粘度和干重浓度都增加，故本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用发酵技术的棒酸生产方法，包括使用带小棒链霉菌的选择株和／或保藏株或其突变体的需氧浸没培养，其中，为了在发酵过程中将滤过培养液中的蛋白质浓度控制于一定限度之内，通过连续或半连续补加一种或多种复合有机氮源优选地大豆粉进行培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AM德阿尔梅达纳贝斯，MM雷加洛达方斯卡，
申请(专利权)人：DSM公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]