提高3-0-乙酰基4”-0-异戊酰基泰乐菌素产量和降低生产成本的方法技术

本发明专利技术是在发酵法合成泰乐菌素衍生物３－Ｏ－乙酰基４”－Ｏ－异戊酰基泰乐菌素时，向发酵液中补入高浓度的Ｌ－亮氨酸溶液或固体悬浮液和高浓度的泰乐菌素溶液，及使用成本较低的液化淀粉液及成本较低的泰乐菌素半成品或中间体作为发酵过程中的补料物，比现有工艺过程显著提高产量及降低生产成本。本发明专利技术通过向Ｌ－亮氨酸溶液或悬浮液加助溶剂，表面活性剂及助悬剂解决了高浓度Ｌ－亮氨酸溶液易结晶沉淀造成的计量不准的问题。本发明专利技术还提供了一种低成本的制备泰乐菌素中间体的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
在已公开的专利US4092473、US4522919中已对3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生产过程及抗菌活性等做了描述。3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素是多种泰乐菌素衍生物中的一种，该物质比泰乐菌素具有更强的抗菌活性。目前已被商品化，并在世界范围内销售。3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生产过程是链霉菌Streptomyces.Thermotolerans发酵2-3天后产生乙酰化酶及异戊酰化酶，在发酵液中加入提供乙酰基的前体物葡萄糖和提供异戊酰基的L-亮氨酸及泰乐菌素，经过乙酰化酶对泰乐菌素3位上进行乙酰化，异戊酰化酶对泰乐菌素4”位进行异戊酰化，经过约190小时的发酵过程，从而完成3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生物合成过程。3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的前体物泰乐菌素本身是一碱性物质，加入酸后变为与加入酸对应的泰乐菌素盐，本说明如不特别指明则是指泰乐菌素碱或泰乐菌素盐。1、通过提高L-亮氨酸的浓度和泰乐菌素的浓度减少补入发酵内的料液的体积，从而达到提高每批发酵液提种后体积的目的。以目前生产使用120立方米的发酵罐为例，培养基经高温灭菌后接入Streptomyces.Thermotolerans菌种，接种后发酵液体积为约66立方米。3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生物合成过程分为明显的微生物菌体繁殖阶段及产物的生物合成阶段。向发酵罐培养基接种接后，微生物生长2-3天完成菌体繁殖阶段。此时补入泰乐菌素与L-亮氨酸的混合液及葡萄糖溶液，开始3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生物合成阶段。由于泰乐菌素有强烈的抑制微生物生长的作用，发酵液中补入泰乐菌素后，微生物菌体基本停止生长。发酵液中补入无菌的1.8％(w/v)的L-亮氨酸溶液及约7.0％(w/v)泰乐菌素混合液约20立方米，同时补入约50％(w/v)的无菌葡萄糖溶液约10立方米。理论计算到发酵完毕后发酵液体积应为96立方米，但由于菌种发酵过程中需通入并排出大量无菌空气，排出的空气带走发酵罐中约14立方米水份，所以到发酵完成后实际得到的发酵液体积约82立方米。在该生物转化过程中，在发酵液中的每克微生物菌体酶活力一定的情况下，影响每批发酵液总产量的因素主要是每批发酵液的微生物菌体总量。所以提高每批发酵液的微生物菌体总量会等比例提高3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的产量。由于L-亮氨酸在常温下在水中的溶解度为2.0-2.5％，如温度降至10℃时其溶解度约为1.8％。所以实际应用中使用了1.4-1.8％浓度的L-亮氨酸。如L-亮氨酸浓度超过1.8％，则L-亮氨酸溶液在冬季气温低于10℃将会结晶析出，使补入发酵液中的L-亮氨酸计量不准确及堵塞补料管道，造成3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的产量降低和发生生产事故等结果。本专利技术将L亮氨酸的浓度提高到了2.1-20％，在此浓度下如不加入本专利技术权利要求书1中所述的增溶剂和表面活性剂，不能溶解的L-亮氨酸固体悬浮于水面上，使补入发酵罐中的亮氨酸计量不准确，甚至堵塞补料管道。加入增溶剂和表面活性剂后及悬浮剂后，不溶于水的L-亮氨酸固体细小颗粒均匀的悬浮于液体中成为流动性很好的悬浮液。泰乐菌素盐水溶液在含量低于10％时，长期放置也不会产生沉淀。如含量超过10％，底温时长期放置会有部分泰乐菌素结晶出现，同样造成补入发酵罐内的泰乐菌素盐计量不准和堵塞管道的问题。加入本专利技术权利要求书2中所述的表面活性剂后，则泰乐菌素盐溶液不会产生结晶。泰乐菌素碱在水中难溶，本专利技术权利要求书中所述的助溶剂、表面活性剂及助悬剂后，便可使泰乐菌素碱均匀分布在水中，成为流动性良好的悬浮液。同时，由于泰乐菌素碱在水溶液中易分解，但以固体颗粒的形式存在于液体中则减少了这种分解现象。更由于在酶的作用下，泰乐菌素、L-亮氨酸是等摩尔反应生成等摩尔的3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素。所以L-亮氨酸的低浓度也必须要求与L-亮氨酸在同一种溶液中的被补入发酵液中的泰乐菌素盐溶液的低浓度。虽然泰乐菌素盐在水中的溶解度可达到40％以上。本专利技术就是将补入的1.4-1.8％L-亮氨酸溶液浓度提高到2.1-20％，同时将补入的原9.0％以下的泰乐菌素盐溶液浓度提高到10-50％。由于每批发酵所补入的泰乐菌素及L-亮氨酸的重量是一定的，相应的补入的体积降低为原工艺过程的1/1.4到1/13。以总容积为120立方米发酵罐为例，如补入发酵罐中的L-亮氨酸和泰乐菌素溶液体积降低为原工艺的1/5，则同样达到发酵完成后每批发酵液体积82立方米，该批发酵液接种后的体积便可达到82立方米，而不是现在使用的66立方米。即接种后体积比原工艺提高了24％，发酵罐的利用率为68.3％，而原工艺接种后体积只有66立方米，发酵罐的利用率只有55％。相应的在微生物菌体繁殖阶段可以得到比原工艺多出24％的微生物菌体量，则每批发酵液3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的产量也可提高20％以上。2、补液化淀粉说明原工艺中提供3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素生物合成菌代谢所需碳源及3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素生物合成所需乙酰基的前体由发酵过程中补入的葡萄糖提供。本专利技术改由经淀粉酶液化后的流动性很好的液化淀粉提供。实验表明，在3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素生产过程中，如发酵液中葡萄糖浓度过高，会降低3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的产率。由于液化淀粉是由短链的葡萄糖的聚合体，而3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生物合成菌可分泌糖化酶将液化淀粉缓慢水解成葡萄糖。因而，液化淀粉相当于葡萄糖的缓释剂，既可起到葡萄糖应起的作用，又使发酵液中的糖浓度控制在较低的水平，更有利于3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的合成。提供同样数量的葡萄糖，液化淀粉的成本比葡萄糖的成本低约30％。使用液化淀粉代替葡萄糖，可降低3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素生产成本约1.0％。3、补泰乐菌素碱或泰乐菌素盐半成品或中间体的说明目前应用的3-O-乙酰基4”-O-异戊酰基泰乐菌素的生产过程是使用含量高达75％以上的成品泰乐菌素酒石酸盐，配制成泰乐菌素酒石酸盐溶液补入发酵液中。该方法成本较高，现广泛使用的生产成品泰乐菌素酒石酸盐生产工艺过程可简单描述为泰乐菌素产生菌经液体发酵140-200小时后用酸调整发酵液pH5.0以下后固液分离得到发酵液滤液，该步加酸及固液分离得到发酵液滤液的收率为约95％。发酵液滤液用碱调pH8.0以上使发酵液滤液中的泰乐菌素成为易溶解于有机溶媒的泰乐菌素碱。用有机溶媒萃取发酵液滤液中所含泰乐菌素碱。该步有机溶媒萃取收率为约95％。该含有泰乐菌素碱的萃取液与酒石酸的水溶液充分混合，使其中的泰乐菌素碱转化成为易溶于水的泰乐菌素盐而转移到水溶液中。该步泰乐菌素碱从有机溶媒中被转移到水中的收率为约95％。该水溶液经用活性炭等脱去色素，并经过超滤膜浓缩后成为含量为3-30％的泰乐菌素的酒石酸盐溶液。该超滤过程泰乐菌素收得率约为90％。该超滤浓缩后的泰乐菌素酒石酸盐溶液经喷雾干燥得到成品泰乐菌素酒石酸盐粉状物。该喷雾干燥过程泰乐菌素酒石酸盐的收得率约为90％。该经喷雾干燥得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高３－Ｏ－乙酰基４”－Ｏ－异戊酰基泰乐菌素产量和降低生产成本的方法，其特征在于，发酵生产３－Ｏ－乙酰基４”－Ｏ－异戊酰基泰乐菌素过程中，使用高浓度的，加入助溶剂或表面活性剂的Ｌ－亮氨酸溶液或高浓度的，加入助溶剂、表面活性剂及助悬剂的Ｌ－亮氨酸固体悬浮液，作为补料物补入发酵液中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兵，
申请(专利权)人：徐兵，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]