肽的制备方法技术

本发明专利技术目的在于提供能够利用基因重组法，有效地、而且大量制备靶肽的方法。对基于右手剪刀（Ｓ－氰化反应）和左手用剪刀（溴化氰处理、肠激酶、因子Ｘａ处理等）切出靶肽和串联重复法进行组合的本发明专利技术方法，可用于大量合成基于基因重组技术的肽、特别是低分子量的肽。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及通过使靶肽以重复连接的前体蛋白质形式稳定地在微生物中表达，然后断裂该前体蛋白的肽键，制备靶肽或其盐的方法。
技术介绍
在合成肽的方法中已知存在有机化学方法、使用酶的方法以及使用基因重组技术的方法等3种方法。其中，就使用基因重组技术的方法来说，肽通过直接表达方法合成是非常困难的。其理由是即使可以使肽直接表达，但制备的肽会被菌体内的蛋白酶一个一个地迅速分解。因此，在使用基因重组技术合成肽时，一般都采用以与保护蛋白形成的融合蛋白形式使其表达的融合蛋白法。作为保护蛋白为了使后面的纯化迅速、且有效地进行，使用能够使用亲和层析法的蛋白A、β半乳糖苷酶等有利。但必须从该融合蛋白特异切出靶肽，人们熟知的切出方法有溴化氰(断裂Met的C末端一侧)等化学方法和使用断裂紧接在所谓的肠激酶断裂位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)或因子Xa断裂位点(Ile-Glu-Gly-Arg)的序列之后的C末端一侧等的酶方法。将作为融合蛋白的保护蛋白FGF突变蛋白(CS23)与作为特异的化学断裂法S-氰化反应组合的新的肽合成法已有报道(EP0887417)。该方法利用CS23对肝素的强亲和力，可以有效、容易地进行融合蛋白的纯化。另外借助于半胱氨酸，通过在该位置的S-氰化反应(对Cys的N末端一侧进行断裂)尝试进行特异断裂，是可以切出靶肽的有用方法，而且也是可能制备很多肽生理活性表达所必需的C末端酰胺体的方法。而该方法可适用于分子内不含有半胱氨酸残基的所有肽。另一方面，一般来说，融合蛋白法的保护蛋白和靶肽之间的分子量差别大，有时不敢说无浪费地利用微生物(大肠杆菌)的蛋白质合成能力也是事实。在此，尝试将几个靶肽基因串联在一个分子中，在菌体内以稳定前体蛋白形式使其表达，然后切出靶肽的串联重复法，但该成功的例子少。其原因是由于以往切出靶肽的N末端一侧，使其露出的方法(可说是左手剪刀)已知有溴化氰处理、因子Xa法等，而适合用于特异切出C末端，使其露出的方法(可说是右手剪刀)还没有。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供利用基因重组法能够有效地、而且大量制备靶肽的方法。本专利技术人等就特异切该C末端，使其露出的方法进行锐意考察，结果意外地发现与先前叙述的S-氰化反应用于融合蛋白法同样，也可在通过串联重复法进行肽的合成中有效地利用，从而完成了本专利技术。就是说，本专利技术人等成功地获得了在串联重复法中必需的左手用、右手用两个剪刀，特别是到目前为止用基因重组法合成困难的分子量小的肽的有效、且大量制备成为可能(图1)。这样一来，通过使这两个断裂方法组合，使用串联重复法有效、且大量制备分子量小的肽成为可能(图2)。即本专利技术提供(1)靶肽或其盐的制备方法(以下，称为制备法A)，其特征是通过酶或化学方式对在靶肽N末端和C末端附加酶或化学断裂位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。(2)上述1记载的制备方法，其特征是通过酶或化学方式对在靶肽的N末端附加酶或化学断裂位点、在C末端附加化学断裂位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。(3)靶肽或其盐的制备方法(以下，称为制备法B)，其特征是用溴化氰或蛋白水解酶对在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端一侧附加蛋氨酸残基时，肽部分没有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白中的各靶肽的N末端一侧进行断裂，在C末端一侧的半胱氨酸或半胱氨酰肽的N末端一侧进行断裂反应。(4)上述(1)～(3)记载的制备方法，其中前体蛋白是重组型前体蛋白。(5)上述(3)记载的制备方法，其中断裂反应是S-氰化反应、然后附加氨分解或水解的反应。(6)上述5记载的制备方法，其中是在2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB)、1-氰基-4-二甲胺吡啶鎓盐(DMAP-CN)或CN-离子存在下进行S-氰化反应。(7)上述(3)记载的制备方法，其中蛋白水解酶是肠激酶、因子Xa或凝血酶。(8)上述(3)记载的制备方法，其中(イ)当使用溴化氰时，在各靶肽的N末端连接蛋氨酸残基，靶肽不含有蛋氨酸残基。(ロ)当蛋白水解酶为肠激酶时，在各靶肽的N末端连接Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等肠激酶断裂位点，靶肽不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys等氨基酸序列。(ハ)当蛋白水解酶为因子Xa时，在各靶肽的N末端连接Ile-Glu-Gly-Arg等因子Xa断裂位点，靶肽不含有Ile-Glu-Gly-Arg等氨基酸序列。(ニ)当蛋白水解酶为凝血酶时，各靶肽的N末端连接Gly-Pro-Arg等凝血酶断裂位点，靶肽不含有Gly-Pro-Arg等氨基酸序列。(9)上述(1)～(3)记载的制备方法，其中靶肽是KiSS-1肽。(10)上述(1)～(3)记载的制备方法，其中靶肽是GPR8配体。(11)GPR8配体或其盐的制备方法，其特征是用肠激酶对在GPR8配体的N末端附加肠激酶断裂序列，在C末端附加半胱氨酸残基后，重复连接3次的前体蛋白中的GPR8配体的N末端一侧进行断裂，以及在C末端一侧的半胱氨酸残基的N末端一侧附加断裂反应。(12)上述(10)或(11)记载的制备方法，其中GPR8配体是含有与序列44表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的多肽。(13)上述(10)或(11)记载的制备方法，其中GPR8配体是含有序列44、序列45、序列46、序列47、序列48、序列49或序列50表示的氨基酸序列的多肽。(14)上述(10)或(11)记载的制备方法，其中GPR8配体是含有序列44氨基酸序列的多肽。(15)一种DNA，含有编码以下前体蛋白的DNA，即，在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端附加蛋氨酸残基时，肽部分不含有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白。(16)一种重组载体，含有上述(15)记载的DNA。(17)上述(16)记载的重组载体，保持在用FERM BP-8023标记的转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pTCGPR3中。(18)转化体，用上述(16)记载的重组载体转化。(19)上述(18)记载的转化体，是用FERM BP-8023标记的转化体大肠杆菌MM294(DE3)/pTCGPR3。(20)前体蛋白或其盐，是在靶肽的N末端一侧附加蛋氨酸残基或蛋白质水解酶断裂序列、在C末端一侧附加半胱氨酸残基或半胱氨酰肽(其中，半胱氨酰肽的肽部分与靶肽不同，而且当N末端一侧附加蛋氨酸残基时，肽部分不含有蛋氨酸残基)并重复连接的前体蛋白或其盐。(21)上述(4)记载的制备方法，其中前体蛋白是对上述(18)记载的转化体进行培养之后制备的重组型前体蛋白。附图说明图1表示本专利技术的肽制备法的概略图。图中，向下的箭头为左手用剪刀(N末端切出以及露出方法)-A，向上箭头为右手用剪刀(C末端切出以及露出方法)-B。作为左手用剪刀如通过溴化氰处理、因子Xa法、肠激酶法等在C末端一侧断裂肽，能够使新的N末端露出的酶。这些方法可以断裂Met或Ile-Glu-Gly-Arg、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的C末端一侧，使靶肽的N末端露出。右手用剪刀通过进行S-氰化，断裂Cys的N末端一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶肽或其盐的制备方法，其特征是：通过酶或化学方式对在靶肽的Ｎ末端和Ｃ末端附加酶或化学上的切断位点并重复连接的前体蛋白进行断裂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：西村纪，末永正人，伊藤隆司，北田千惠子，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]