生产ＰＦ１０２２物质衍生物的转化体及其制备方法以及新型生物合成基因技术

本发明专利技术的目的在于：提供通过直接发酵法制备ＰＦ１０２２物质衍生物、特别是ＰＦ１０２２－２２０和ＰＦ１０２２－２６０的方法，以及该方法中所使用的转化体。根据本发明专利技术还提供：可以通过将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因导入由生产ＰＦ１０２２物质的生物诱导的苯丙氨酸营养缺陷型宿主中而获得的生产ＰＦ１０２２物质衍生物的转化体。根据本发明专利技术又提供：ＰＦ１０２２物质衍生物的制备方法，所述方法包含培养上述转化体，并且收集ＰＦ１０２２物质衍生物的步骤。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术涉及生产PF1022物质衍生物的转化体以及使用该转化体制备PF1022物质衍生物的方法。本专利技术还涉及参与由分支酸到苯丙酮酸的生物合成途径的新型基因。
技术介绍
PF1022物质具有驱虫活性，是有望应用于药物、动物药领域的物质。PF1022物质是式(I) 所示的环状缩肽，已知可通过发酵法制备(特开平3-35796号)该PF1022物质是由L-N-甲基亮氨酸(缩写H-L-MeLeu-OH)、D-乳酸(缩写H-D-Lac-OH)和D-苯基乳酸(缩写H-D-PhLac-OH)通过酯键和酰胺键连接而构成的环状缩肽。另外，PF1022物质也可以以式(II)表示。式(II)环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)关于PF1022物质衍生物，已报道可通过发酵法制备PF1022B、PF1022C、PF1022D、PF1022E、PF1022F、PF1022G和PF1022H7种衍生物(特开平5-170749号、特开平6-184126号、WO98/05655号)。另外通过化学合成方法也可以制备具有驱虫活性的各种PF1022物质衍生物(WO94/19334号、WO97/11064号、特许第2874342号)。其中式(III) 或式(IV)环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO2PhLac)表示的PF1022物质衍生物PF1022-220和式(V) 或式(VI)环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH2PhLac)表示的PF1022物质衍生物PF1022-260不仅其自身具驱虫活性，作为其他具有强力驱虫活性的PF1022物质衍生物的合成原料也是非常有用的物质(特许第2874342号)。不过，PF1022-220和PF1022-260只能通过化学合成的方法制备。制备像PF1022物质那样具有复杂的环状母核的环状缩肽时，发酵法的制备方法与化学合成的制备方法相比，通常在实施时，在所需的全部时间、劳力、经费及其它方面有利，且便于实施。因此，对于PF1022-220和PF1022-260所代表的PF1022物质衍生物，也希望采用直接发酵法来制备。本专利技术人已将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因导入生产具有对位未被含氮原子的官能团取代的苯环骨架的次级代谢产物的生物中，获得了转化体，并已进一步确立了使用该转化体制备具有对位被含氮原子的官能团取代的苯环骨架的次级代谢产物的方法(WO01/23542号)。专利技术概要本专利技术人在将WO01/23542号所记载的方法用于生产PF1022物质的宿主时，可以证明得到的转化体制备式(VII) 或式(VIII)环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NO2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)所示的PF1022物质衍生物PF1022-268，以及式(IX) 或式(X)环(L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-p-NH2PhLac-L-MeLeu-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac)所示的PF1022物质衍生物PF1022-269，但不能证实可制备PF1022-220和PF1022-260。另一方面，本专利技术人从生产PF1022物质的生物中诱导了苯丙氨酸营养突变型菌株，用含有参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的多个基因的DNA转化该突变菌株，成功地获得了新型生产PF1022物质衍生物PF1022-220和PF1022-260的转化体。本专利技术基于上述认识。本专利技术的目的在于提供通过直接发酵法制备PF1022物质衍生物、特别是制备PF1022-220和PF1022-260的方法，以及该方法所使用的转化体。根据本专利技术，提供生产PF1022物质衍生物、特别是PF1022-220(式(III))和PF1022-260(式(V))的转化体，所述转化体可通过将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因(生物合成基因)导入从生产式(I) 所示的PF1022物质的生物中诱导的苯丙氨酸营养缺陷型宿主中而获得。根据本专利技术，还提供PF1022物质衍生物的制备方法，其特征在于培养上述转化体，收集PF1022物质衍生物。本专利技术的目的还在于提供与由分支酸到氨基苯丙酮酸的生物合成途径有关的新型基因。本专利技术的新型基因是编码SEQ ID NO.27所示的氨基酸序列或具有分支酸变位酶活性的其修饰序列的多核苷酸，以及编码SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列或具有预苯酸脱水酶活性的其修饰序列的多核苷酸。附图简述附图说明图1显示从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)中分离的DNA片段的限制性酶切图谱和可读框(ORF)的位置。图2显示质粒pTrc-papA的构建。图3显示用于检出papA基因产物的酶活性的氨基酸分析仪的色谱图。图4显示质粒pTrc-papB的构建。图5显示用于检出papB基因产物的酶活性的氨基酸分析仪的色谱图。图6显示质粒pET-papC1的构建。图7显示用于检出papC基因产物的酶活性的氨基酸分析仪的色谱图。图8显示质粒pPF260-A3和质粒pPF260-A4的构建。图9显示含有Abp1基因的6kbHindIII片段的限制性酶切图谱。图10显示质粒pABPd的限制性酶切图谱。图11显示质粒pPF260-B3的构建。图12显示质粒pPF260-C3的构建。图13显示XbaI DNA片段的限制性酶切图谱和分支酸变位酶基因的位置。图14显示质粒pCMHRV4的构建。图15显示用于检出PF1022物质衍生物PF1022-220的HPLC色谱图。A显示PF1022-220标准品的色谱图、B显示从转化体中制备的试样的色谱图、C显示从转化体中制备的试样和PF1022-220标准品的色谱图。图16显示用于检出PF1022物质衍生物PF1022-260的HPLC色谱图。A显示PF1022-260标准品的色谱图、B显示从转化体中制备的试样的色谱图。图17显示从PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因组DNA中分离的SacI片段的限制性酶切图谱和PDT基因的位置。图18显示质粒pDPDT的限制性酶切图谱。图19显示用于检出PF1022物质衍生物PF1022-220的HPLC色谱图。A显示从TF-57菌株中制备的试样的色谱图、B显示从TF-45菌株中制备的试样的色谱图。专利技术详述微生物保藏PF1022菌株于1989年1月24日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-2671。由质粒pUC118-papA转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)于1999年9月17日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6)。保藏号为FERM BP-7256。由质粒pTrc-papB转化的大肠杆菌(大肠杆菌JM109)本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产ＰＦ１０２２物质衍生物的转化体，所述转化体可通过将参与由分支酸到对氨基苯丙酮酸的生物合成途径的基因（生物合成基因）导入由生产式（Ⅰ）＊＊＊（Ⅰ）所示的ＰＦ１０２２物质的生物诱导出的苯丙氨酸营养缺陷型宿主中而获得。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：矢内耕二，隅田奈绪美，渡边学，守屋达树，村上健，
申请(专利权)人：明治制果株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]