肽的制造方法技术

一种制造含多肽物质的方法，通过在成年雌性哺乳动物乳腺中表达ＤＮＡ顺序，将用肽编码的ＤＮＡ顺序掺入用乳剂乳清蛋白质编码的哺乳动物（例如羊）基因中，这种物质可以是（任意改性的）蛋白质，例如血凝固因子。最好将ＤＮＡ顺序插入用乳剂蛋白质，例如β－乳球蛋白，编码的第一个基因外显子中。一般从雌性哺乳动物乳剂中回收该物质，而且可以在原位使用（例如假若它是酶）。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于制造一种含多肽物质的方法，特别是关于制造蛋白质的方法，以及用酶类蛋白质催化制备生物物质的方法。在过去的十年里，复合DNA技术越来越多地用于制造工业上重要的生物物质。为此，对用多种医学上重要的人体蛋白质编码的DNA顺序已进行了无性繁殖，它包括胰岛素、血纤维蛋白溶酶原活化剂、α1-抗胰蛋白酶、以及凝固因子Ⅷ和Ⅸ。目前，虽然出现了复合DNA技术，然而这些蛋白质通常从血液和细胞组织中提纯，该方法成本昂贵且费时，并且可能会引起传染介质的传播，这些传染介质会引起艾滋病和肝炎。尽管在细菌中表达DNA顺序，对于产生所需的医学上重要的蛋白质来说是一个吸引人的计划，然而事实上细菌作为宿主通常是不能令人满意的，因为在细菌细胞中，外来蛋白质不稳定而且没有合格处理过。认识到这个问题，人们对在哺乳动物细胞组织培养物中的无性系基因的表达方式作了尝试，而且在某种情况下已经证明这是一个可行的策略，然而动物细胞的间歇发酵是昂贵的、但却是技术上需要的过程。因此，需要一种产率高、成本低的制造生物物质，例如经恰当修饰的真核生物多肽的方法，这种方法的一个优点是对人体没有传染介质。根据本专利技术的第一方面，提供一种制造含多肽物质的方法，该方法包括通过在成年雌性哺乳动物乳腺中表达DNA顺序，将用多肽编码的DNA顺序掺入到用乳剂乳清蛋白质编码的哺乳动物基因中。该物质一般在转译后修饰之前或者最好是在之后从成年雌性哺乳动物的乳剂中回收。在本说明书中使用的术语“多肽”是指包含氨基酸链的分子，无论链的长度对于划为蛋白质是否合适，多肽最好具有足够长的分子而成为蛋白质。“含多肽物质”可以是多肽本身，或者是改性的(例如糖基化的)多肽，或者此外也可以是在多肽经转译后修饰之后，交叉连接的物质。本专利技术可用于生产肽激素、血液凝固因子(特别是因子Ⅷ和Ⅸ)或它们的亚基(特别是因子Ⅷ和Ⅸ)、血液蛋白质(例如β-珠蛋白)和血清蛋白(例如α1-抗胰蛋白酶)、粮食蛋白、包括天然或改进的宿主哺乳动物的乳蛋白、或酶。本专利技术产生的酶能在原位作用于乳腺底物，因此，可以看出本专利技术包括一种生产酶反应产物的方法，该方法是通过在成年的雌性哺乳动物乳腺中表达DNA顺序，将用酶编码的DNA顺序掺入用乳剂乳清蛋白编码的哺乳动物基因中，然后由一种或多种酶作用物来催化制备反应产物，该反应产物一般从成年的雌性哺乳动物乳剂中回收。最好在试管中，将用肽编码的DNA顺序(“所需的DNA顺序”)掺入到乳剂乳清蛋白质基因中形成融合基因，这种蛋白基因可以在成年的雌性哺乳动物中表达。通过向已受精的哺乳动物卵注射融合基因，从而将融合基因插入种系中，此后，注射过的受精卵发育为成年的雌性哺乳动物。人们预计并非所有注射过的卵都能发育成所需的DNA顺序表达的成年雌性哺乳动物。此外，将近一半的动物是雄性，在下一代生育雌性动物。而关于外来DNA顺序可以插入到哺乳动物种系中的有关技术已用于小鼠。目前，最有效的途径需要将几百个直链DNA分子直接显微注射到受精卵细胞的原核中，这是本专利技术的优选方法。显微注射过的卵然后转移到假孕养母的输卵管中，进行培养。Brinster et al在Proc Natl Acad Sci 82(1985)4438-4442中报道培养的小鼠大约有25%继承了一个或多个显微注射的DNA拷贝。从商业观点出发，显然在本专利技术中，最好将具有高乳剂产率的哺乳动物作为宿主哺乳动物。因此，优先选用家畜，例如绵羊、猪和羊，下面将进一步详细讨论。研究大量家畜需要相当大的投资，尤其是在所需动物的数目及其成本方面。每个超数排卵的小鼠产生30个卵是正常的，而母羊排卵数只有3至5个。所遇到的另一个问题是农场动物的卵还不透明，这是由于它存在大量的囊，这就使得鉴别及向其原核进行成功注射更为困难。然而，向兔子、绵羊和猪的卵中注射DNA已由Hammer et al在Nature 315(1985)680-683中作了报道，他将金属硫固生长激素融合基因注入这三种动物种系中。这2035个猪卵进行注射并转移，有192只小猪出生，其中20只带有融合基因。该结果对绵羊却并不如此令人鼓舞，对1032个羊卵进行注射并转移，但只有73只羊出生，其中只有一只羊含有外来DNA顺序。只要将外来DNA并入种系，外来DNA就可以在高选择性的细胞组织内表达，生成一种功能蛋白质，这种蛋白质可以很容易地从动物中获取。要进行这个过程，一般将用所需的肽编码的DNA顺序融合到DNA顺序中，或介导在合适组织内表达的顺序。尽管对小鼠进行的最初实验表明加入DNA的细胞组织的专一表达是略有不同的(例如，Lacey et al，Cell 34(1983)343-356)，但是，现在一般的相符性是大多数转染基因的标准细胞组织专一的表达可得到的。参阅Brinster et al Cell 27(1981)223-231;Swift et al Cell 38(1984)639-646;Shani Nature 314(1985)283-286;和Magram et al Nature 315(1985)338-340。关于标准的细胞组织特异性，它对于去除所有原核生物的载体顺序显然是重要的，在显微注射前，它用于所需的DNA顺序的无性繁殖方面(Krumlauf et al Mol.Cell Biol 5(1985)1639-1648)。这些出版物指出的是将某些不同的细胞组织在基因转移动物中当作目标，而没有提出需要任何特殊的细胞组织来生产含多肽的物质，也没有提出任何用给定的细胞组织表达的，并用来作为引入DNA表达的目标的特殊基因。关于含肽物质和其直接表达的细胞组织，必须考虑到许多因子。为了显示充分的生物活性，许多蛋白质需要广泛的转译后修饰。例如因子Ⅸ需要将用于生物活性的谷氨酸残余物的特定子集进行γ-羧化(De Seipio and Davie、Biochemistry 18 899-904(1979))。肝是天然合成因子Ⅸ的部位，它能熟练地进行这种修饰，尽管效率较低。成纤维细胞能够进行因子Ⅸ的γ-羧化de la Salle et al Nature 316 268-270(1985)。然而，只有当在特异组织中合成时才可恰当修饰某种蛋白质，有时必须使表示的部位适合生产蛋白质的需要。可以认为使用乳腺作为细胞组织来表达，不论满意程度如何，这是一个潜在的困难因素。与固体细胞组织相反，蛋白质需要从体液中获得，因为该途径一般说来是可以重复的，并且大部分生物医学上重要的蛋白质本身是分泌到体液中的。从肝或β淋巴细胞分泌到血流中是一个可行的途径，但是血液的凝固性质以及生物活性肽的抗原分子的存在是进行后续过程的障碍。根据本专利技术，可以通过使用乳腺表达细胞组织来克服以上困难，乳剂很容易大量收集，并且有较好的生物化学特性，此外，主要的乳剂蛋白质以高浓度存在于乳剂中(大约1～15g/l)。世界上许多国家的农场动物一般有四种猪、山羊、绵羊和牛，也就是说Suidae本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制造含多肽物质的方法，其包括通过在成年的雌性哺乳动物乳腺中表达ＤＮＡ顺序，将用多肽编码的ＤＮＡ顺序掺入用乳剂乳清蛋白质编码的雌性哺乳动物基因中。

【技术特征摘要】
GB 1986-6-30 86159421.一种制造含多肽物质的方法，其包括通过在成年的雌性哺乳动物乳腺中表达DNA顺序，将用多肽编码的DNA顺序掺入用乳剂乳清蛋白质编码的雌性哺乳动物基因中。2.根据权利要求1所述的方法，其中含多肽物质是从成年雌性哺乳动物的乳剂中回收。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中含多肽物质是在转录后修饰的乳剂中回收。4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中含肽的物质是蛋白质。5.根据权利要求1至4之一所述的方法，其中含多肽的物质是人体血浆蛋白质。6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中含多肽的物质是肽激素。7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中含多肽物质是血液凝固因子或血液凝固因子的亚基。8.按照权利要求1至4之一所述的方法，其中含多肽的物质是酶。9.一种制造酶反应产物物质的方法，其包括通过在成年的雌性哺乳动物乳腺中表达DNA顺序，将用酶编码的DNA顺序掺入用乳剂乳清蛋白质编码的哺乳动物基因中，从而由一种或多种酶的产物催化形成反应产物。10.根据权利要求9所述的方法，其中反应产物从成年雌性哺乳动物乳剂中回收。11.根据权利要求1至9之一所述的方法，其中用多肽编码的DNA顺序在试管内掺入可在成年雌性哺乳动物乳腺中表达的乳清蛋白质基因中，形成融合基因，通过将融合基因注射到受精卵或哺乳动物胚胎细胞中，将融合基因掺入种系中，然后使被注射的受精卵或胚胎发育为成年雌性哺乳动物。12.根据权利要求11所述的方法，其中向两个细胞的胚胎核进行注射。13.根据权利要求11所述的方法，其中将直链DNA分子注射到卵的原核或核上。14.根据权利要求1至13之一所述的方法，其中哺乳动物是家畜哺乳动物。15.根据权利要求14所述的方法，其中哺乳动物选自Suidae科，Ovis属，Capra属，以及Bos属。16.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼约翰克拉克，理查德莱恩，
申请(专利权)人：药物用蛋白质有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]