一种原始霉素的高效发酵方法技术

始旋链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）ＣＧＭＣＣ　　　０９５７。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用始旋链霉菌CGMCC 0957发酵，高效生产原始霉素的方法。
技术介绍
原始霉素(pristinamycin)属于链阳性菌素类抗生素，由约30％的原始霉素I和约70％的原始霉素II组成。原始霉素I为环六肽内酯，由原始霉素IA、原始霉素IB和原始霉素IC组成。原始霉素IA的分子量为866，分子式为C45H54O10N8；原始霉素IB的分子量为852，分子式为C44H52O10N8；原始霉素IC的分子量为852，分子式为C44H52O10N8。原始霉素II为多不饱和环内酯，由原始霉素IIA和原始霉素IIB组成。原始霉素IIA的分子量525，分子式为C28H35O7N3；原始霉素IIB的分子量527，分子式为C28H37O7N3。原始霉素IA和原始霉素IIA是原始霉素的主要组分。原始霉素主要对革兰氏阳性菌尤其是金葡菌和链球菌有较好的抗菌活性，其作用机理为作用于细菌核糖体50S亚基，抑制细菌蛋白质的合成。原始霉素I组分和II组分之间具有协同作用。现有技术中，美国专利US3154475(1964年)和英国专利GB998195(1965年)中描述了生产原始霉素的传统发酵和提取方法。在这两个专利中所用的菌种为始旋链霉菌，特别是菌株5647，或NRRL 2958，所用的发酵培养基为培养链霉菌的营养培养基，特别是含有黄豆粉和葡萄糖的培养基能产生较好的结果。在这两个专利的实例中提供了原始霉素发酵生产的种子培养基和发酵培养基在170升种子罐中所用种子培养基含酶水解酪素1200克、葡萄糖1200克、麦芽提取物360克、自来水100升、豆油60毫升；在800升发酵罐中所用的发酵培养基含黄豆粉17.75千克、distiller’s solubles 2.25千克、氯化钠2.25千克、豆油1800毫升、碳酸钙2.25千克、自来水360升。用此培养基发酵生产原始霉素，原始霉素的发酵效价为1190u/ml。由于原始霉素的发酵效价较低，因此生产成本较高。
技术实现思路
为了克服现有原始霉素发酵效价低、生产成本高的缺点，本专利技术提供一种Streptomyces pristinaespiralis微生物。本专利技术提供一种生产原始霉素的高效发酵方法。本专利技术的发酵方法能将原始霉素的发酵效价提高到3000-5000u/ml。使用的微生物Streptomyces pristinaespiralis属于链霉菌属始旋链霉菌种，为放线菌。Streptomyces pristinaespiralis已于2003年6月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为0957。使用的微生物的具有如下的性质菌种的菌学特性(a)形态特征孢子丝波曲或松螺旋形，1-3圈。孢子卵圆形，表面带疣。在无机盐淀粉琼脂、甘油天冬素琼脂和酵母麦牙膏琼脂上气生菌丝灰色，基内菌丝反面无色至灰黄或浅黄褐，可溶色素无或少量黄色，不产生黑色素。(b)碳源利用可利用木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、棉子糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、肌糖。不利用或生长可疑山梨糖、乙二醇、赤藻糖醇、己六醇、山梨醇、乙醇、乙酸钠、油酸钠、甲酸钠、琥珀酸、葡萄糖酸钙。(c)氮源利用可利用硝酸钠、亚硝酸钠、硫酸氨、腺苷、尿素、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、 组氨酸、蛋白胨、酵母抽提物、黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、鱼粉。不利用或生长可疑乙酰胺、琥珀酸盐、苯甲酰胺、肌氨酸、肌氨酸酐、甜菜碱。任何能产生原始霉素的菌种都适用于本专利技术。优选的菌种为始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)，该菌种在美国标准菌种收藏所(ATCC)和美国农业部北方开发利用研究部(NRRL)均有保存，编号分别为ATCC 25486和NRRL 2958。更优选的菌种为Streptomyces pristinaespiralis CGMCC 0957。本专利技术还涉及用产生原始霉素的菌种进行发酵生产原始霉素的方法，具体包括种子的制备和发酵生产。为了提高原始霉素产量，需要采用改进的种子培养基和发酵培养基。改进的培养基与现有技术的上述两个专利中的培养基有很大区别，使用本专利技术的培养基可以大幅度地提高原始霉素的产量。本申请中所有的培养基的百分比是培养基成分的质量与种子培养基的总体积之比，单位是克/毫升或公斤/升(即g/ml或kg/l)。改进的种子培养基含有a)2-5％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等。b)1-4％的有机氮源，合适的有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等。改进的发酵培养基含有a)4-8％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括缓慢利用碳源和快速利用碳源以2∶1到6∶1的比例加入。缓慢利用的碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、纤维二糖等；优选的缓慢利用的碳源包括淀粉。快速利用的碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘油等；优选的快速利用碳源为葡萄糖。b)2-5％(W/V，培养基成分的质量与发酵培养基的总体积之比)的有机氮源，合适的有机氮源包括缓慢利用有机氮源和快速利用有机氮源以3∶1到8∶1的比例加入。合适的缓慢利用有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉和玺粉等；合适的快速利用有机氮源包括蛋白胨、酵母粉等。c)0.1-1％(W/V，培养基成分的质量与发酵培养基的总体积之比)的无机氮源，合适的无机氮源为KNO3、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3等，优选的无机氮源为(NH4)2SO4。使用具有上述特征的培养基是实现本专利技术高水平发酵生产原始霉素的主要方面。将产生原始霉素的菌种(如始旋链霉菌)的孢子培养物接种到本专利技术的种子培养基中制备种子，再将种子接种到发酵培养基中进行发酵以生产原始霉素。孢子培养物的制备将产生原始霉素的菌种(如始旋链霉菌)接种到产孢子培养基上培养，产孢子培养基可以采用高氏1号培养基、ISP2培养基，更优选的是高氏1号培养基。合适的培养温度为20-40℃，优选培养温度为25-37℃，更优选的培养温度是30℃。培养时间为2-15天，优选为5-10天，更优选是6天。种子的制备合适的种子培养基含有1)2-5％的可利用碳源，合适的可利用碳源包括淀粉、糊精、麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等。2)1-4％的有机氮源，合适的有机氮源包括黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等。种子培养基的制备种子培养基可通过传统技术(如在120-140℃分别或同时灭菌碳源和氮源)制备。接种将孢子培养物制成孢子悬浮液后接种到种子培养基中或用挖块法直接接种到种子培养基中培养制备种子。培养种子培养采用深层液体沉没培养法，根据规模大小在摇瓶或种子罐中进行。在摇瓶培养时通过瓶口介质过滤空气(通过控制摇瓶装液量来控制，摇瓶装液量为摇瓶体积的10-20％)，并通过摇床振荡(摇床转速为150-250转/分)使无菌空气中的氧气与培养基和菌种充分接触；在种子罐中培养时通过通入无菌压缩空气和搅拌提供氧气(通气量为每分钟每升发酵液0.5-1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金志华，李春波，岑沛霖，张国钧，金一平，陶正利，林建平，徐志南，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：