一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：原料预处理，酶解浸提，酸化滤液，将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱、用氨水洗脱、得氨水洗脱液，对氨水洗脱液进行膜分离除杂、浓缩，浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析、氨水洗脱、分段收集洗脱液，浓缩结晶、干燥，得1-脱氧野尻霉素精品；所述酶解浸提步骤使用了组合酶，其成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3-5∶2-4∶1。本发明专利技术高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法采用酶解手段，与本发明专利技术除杂、纯化等技术特征的有机结合，使得本发明专利技术提取方法具有目标产物的提取率和纯度均较高，纯度高于98％；环保无污染，提高了产品质量安全等优点。

Method for extracting high purity 1- deoxy Su Su

The invention discloses a method for extracting high purity 1- deoxynojirimycin, which comprises the following steps: raw material pretreatment, enzymatic extraction, acidification of the filtrate, the filtrate was acidified on strong acid cation exchange resin column, eluting with ammonia, ammonia eluent, elution solution of ammonia separation and impurity removal and concentration of membrane the concentrated liquid, after weak acidic cation exchange resin column by column chromatography, ammonia water elution, collecting the eluent concentration section, crystallization and drying, 1- deoxynojirimycin products; extraction process uses the combination of enzymatic hydrolysis, the composition and the weight ratio of cellulose enzyme, pectinase glucanase: = 3-5: 2-4: 1. The extraction method of the invention is of high purity 1- deoxynojirimycin by enzymatic method, combined with the invention of impurity and purification technology of feature extraction method, the extraction rate of the invention has the advantages of the product and purity are high, the purity is higher than 98%; no environmental pollution, improves product quality and safety etc..

【技术实现步骤摘要】
一种1-脱氧野尻霉素的提取方法
本专利技术涉及从植物中提取天然物质的方法，特别涉及一种1-脱氧野尻霉素的提取方法。
技术介绍
桑叶为桑科(Moraceae)桑属植物(MorusL.)的叶，是国家卫生部公布的药食两用植物，全国大部分地区均有栽培生产，以南方蚕桑生产地区产量最多，如江苏、广西、浙江、安徽、四川等。桑叶味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏散风热，清肺润燥，平肝明目，凉血止血之功效。历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症。现代医学在研究桑叶化学成分和动物实验基础上，发现桑叶具有降血压、降血糖、降低胆固醇、抗肿瘤、抗过敏及利尿等功能。在桑叶、桑枝中起到主要药理作用的成分是1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)是一种哌啶类多羟基生物碱，英文名称1-Deoxynojirmycin，简称1-DNJ，化学名称是3，4，5-三羟基-2-羟甲基四氢吡啶，分子式为C6H13NO4，分子量为163，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤转移等多种生物活性。到目前为止的研究成果中，自然界以桑叶中天然含量最高。1-DNJ作为一种糖苷酶抑制剂具有良好的开发前景和用价值因而由桑叶中提取1-DNJ已成为国内外学者研究的焦点。在我国，1-脱氧野尻霉素产品尚未进行工业化生产。国内虽然有大学院校、科研院所进行小试的报道，但主要集中于对粗产品的研制和应用的研究，极少有对高纯度1-脱氧野尻霉素提取工艺的研究报道，高纯度1-脱氧野尻霉素的工业化生产进展缓慢。中国专利200910192542.2公开了一种1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的提取方法，主要步骤为：(1)将桑叶和40％-80％乙醇按照料液比1∶6-40投料，混合于50-70℃搅拌1-3小时，离心过滤得到滤液A；(2)滤渣按料液比1∶6-40投料，混合于50-70℃搅拌1-3小时，离心过滤得到滤液B，合并滤液A和B，在50-70℃下减压浓缩得浓缩液，同时回收乙醇；(3)浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀；(4)压滤除去沉淀，滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱；(5)滤液加入结束后用纯净水洗，待大孔树脂流出液无色时，将其断开，再用0.1-0.5mol/L的氨水或含氨0.1-0.5mol/L的5％-50％乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ)，将洗脱液用酸调节至pH3-5，再上阳离子树脂柱，待洗脱液上完后，用纯净水洗至流出液无色，再用10％-70％的乙醇溶液洗；(6)乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0.1-0.5mol/L的氨水洗脱，收集洗脱液，用纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质，浓缩液喷雾干燥，得到黄棕色粉末1-脱氧野尻霉素。该专利方法通过乙醇水溶液提取，经絮凝剂沉淀，再经由连续阳离子交换树脂和大孔吸附树脂方法除杂，浓缩，干燥得黄棕色粉末1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。该方法最大的缺陷在于，对桑叶中所含的主要功效成分1-脱氧野尻霉素的提取率不高，而且仅能制取纯度低的含1-脱氧野尻霉素的生物总碱，无法提取含量高达98％以上的高纯度1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。中国专利200910167602.5中公开了一种提取高纯度1-DNJ的方法，其主要步骤为：(1)桑叶经洗涤烘干后粉碎，过40目筛。称取桑叶粉50Kg，加入400L65％乙醇，60℃800Hz超声提取30分钟，过滤，滤渣加入200L65％乙醇，60℃800Hz超声提取30分钟，过滤，合并的滤液A，滤渣待用；(2)滤液A加入2mol/L盐酸，调节pH＝2，减压浓缩至20L，抽滤，滤渣待用；将滤液加入100Kg717阴离子交换树脂，搅拌15分钟，闷置6小时后将放出液体，流出液加入原阴离子树脂，重复3次，加入300L水洗脱，收集流出液和洗水，浓缩至20L，得到浓缩液B；(3)将浓缩液B以300Kg732树脂柱层析纯化上样后，纯化水洗至洗水无色，以0.5mol/L氨水洗脱，收集pH9-12段洗脱液，膜浓缩至10L。加入2mol/L盐酸，调节pH＝7；分3次加入3L氯仿萃取，保留水相、减压浓缩至6L，分6＝5次加入10L正丁醇液萃取；(4)将正丁醇萃取液浓缩至1L，抽滤，滤渣以无水乙醇结晶，析出物溶于100ml纯化水，通过SepHdexLH-20凝胶柱层析，纯化水洗脱，以99％纯度1-脱氧野尻霉素标准品对照，收集薄层色谱Rf值和斑点颜色均一致部分，浓缩至干，得成品31.82，其中目标产物1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量98.68％。中国专利200910167602.5公开的上述方法通过超声波提取，经由酸化，阴离子树脂柱交换，阳离子树脂柱层析纯化得洗脱液，由有机萃取剂多次萃取，结晶，浓缩干燥，得到较高纯度的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)。但该方法大量且多次的使用了氯仿以及正丁醇等有毒有机溶剂，而有毒溶剂难以去除，非常容易混入最终产品中，使该方法存在着加重环保负担，终产品毒性不确定，产品安全性难以得到保证的缺陷；且提取率较低，仅约为0.06％。综上，现有提取1-DNJ的方法，主要存在着产品提取率和纯度低，产品毒性较大，不利于环保的缺点，并且现有提取方法对原料要求较高，主要选用1-脱氧野尻霉素含量较高的桑叶或桑皮部分，未能对桑树的其它部位或蚕桑废弃物加以利用；进一步的，现有提取方法对原料的利用率极低，未能将附加值产品得到充分利用，对资源造成了较大浪费。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中所存在的产品提取率和纯度低、产品毒性大的不足，提供一种提取率高、产品安全、利于环保的高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：一种高纯度1-脱氧野尻霉素的提取方法，包括如下步骤：(1)原料预处理：取桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蚕桑废弃物，经由干燥后粉碎，得原料粉末；(2)酶解浸提：向原料粉末加入8-12倍重量水，升温至45-60℃后，加入原料粉末重量0.5％-1％的组合酶，保温，酶解浸提8-12小时，过滤，得滤液；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3-5∶2-4∶1；(3)调节浸提滤液pH值为4-5，得酸化滤液；(4)将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱，用2-4倍树脂体积量的纯化水冲洗，收集得到水洗液，然后用2-4倍树脂柱体积量的0.1-0.5mol/L氨水进行洗脱，收集pH＝9-12的洗脱液，得到氨水洗脱液；(5)将氨水洗脱液经过纳滤膜(200D)进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩器除氨后得到浓缩液；(6)将浓缩液经过弱酸性阴离子树脂柱进行柱层析，使用浓度为0.1-0.5mol/L氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品。本专利技术所述蚕桑废弃物可以是喂养蚕结束后的桑叶，或蚕的排泄物(蚕砂)等。为了提高上述提取方法对目标产物的提取率和提取效率，上述步骤(2)所述组合酶的成分及其重量比优选为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝4∶3∶1。为了进一步提高上述提取方法对目标产物的提取率和提取效率，上述步骤(2)中组合酶的用量优选为0.6-0.8％，以0.7％为最佳。上述步骤(2)中水的用量优选为10倍原料粉末重量。为了充分利用原料，并为了提高上述提取方法对目标产物的提取率，上述步骤(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度1?脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)原料预处理：取桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蚕桑废弃物，经由干燥后粉碎，得原料粉末；(2)酶解浸提：向原料粉末加入8?12倍重量水，升温至45?60℃后，加入原料粉末重量0.5％?1％的组合酶，保温，酶解浸提8?12小时，过滤；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3?5∶2?4∶1；(3)调节浸提滤液pH值为4?5，得酸化滤液；(4)将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱，用2?4倍树脂体积量的纯水冲洗，收集得到水洗液，然后用2?4倍树脂柱体积量的0.1?0.5mol/L氨水进行洗脱，收集pH＝9?12的洗脱液，得到氨水洗脱液；(5)将氨水洗脱液经过纳滤膜进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩后得到浓缩液；(6)将浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析，用浓度为0.1?0.5mol/L的氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，得成品。

【技术特征摘要】
1.一种1-脱氧野尻霉素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)原料预处理：取桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹和/或蚕桑废弃物，经由干燥后粉碎，得原料粉末；(2)酶解浸提：向原料粉末加入8-12倍重量水，升温至45-60℃后，加入原料粉末重量0.5％-1％的组合酶，保温，酶解浸提8-12小时，过滤；所述组合酶的成分及其重量比为纤维素酶∶葡聚糖酶∶果胶酶＝3-5∶2-4∶1；(3)调节浸提滤液pH值为4-5，得酸化滤液；(4)将酸化滤液上强酸性阳离子树脂柱，用2-4倍树脂体积量的纯水冲洗，收集得到水洗液，然后用2-4倍树脂柱体积量的0.1-0.5mol/L氨水进行洗脱，收集pH＝9-12的洗脱液，得到氨水洗脱液；(5)将氨水洗脱液经过纳滤膜进行膜分离滤除大分子杂质，经由薄膜蒸发器浓缩后得到浓缩液；(6)将浓缩液经过弱酸性阳离子树脂柱进行柱层析，用浓度为0.1-0.5mol/L的氨水洗脱，分段收集洗脱液，以标准品对照，收集斑点颜色均一致部分，浓缩结晶，真空干燥后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤世江，
申请(专利权)人：成都科源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：