一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术和动物疫病诊断领域，具体公开了一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用。本发明专利技术提取B型鼻气管炎鸟杆菌的脂多糖作为包被抗原，该纯化的抗原对ORT具有很强的特异性、敏感性，可一次性实现对18个血清型ORT的检测，能真实准确地反应鸡群中ORT的抗体水平。本发明专利技术使用辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG作为酶标抗体，可广泛针对禽类，如鸡、鸭和鹅等进行通用性的检测，提高了本试剂盒的通用性。

A kit for the detection of Mycobacterium nasi and its preparation and Application

The invention relates to the field of biological technology and the diagnosis of animal epidemic disease, and specifically discloses a kit for detecting the bacilli of the naso trachea and its preparation method and application. The present invention extracts lipopolysaccharide from B type nosotracheitis and its lipopolysaccharide as a coated antigen. The purified antigen has strong specificity and sensitivity to ORT, and it can detect 18 serotypes ORT at once, and it can accurately and accurately reflect the level of ORT antibody in chickens. The invention uses horseradish peroxidase labeled Rabbit anti avian IgG as an enzyme labelled antibody, which can be widely used for detecting poultry, such as chickens, ducks and geese, and improves the versatility of the kit.

【技术实现步骤摘要】
一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物技术和动物疫病诊断领域，具体地说，涉及一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒。
技术介绍
鼻气管炎鸟杆菌病是由鼻气管鸟杆菌(Ornithobacteriumrhinotracheale，ORT)引起的肉鸡和火鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。该病以呼吸道困难、生长障碍及严重的纤维素性化脓性肺炎和气囊炎为特征。而且易继发或并发大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、败血支原体及传染性支气管炎、新城疫、鸡传染性贫血病等细菌和病毒的感染，导致鸡群出现大量死亡。目前，该病在世界许多国家和地区的流行正呈上升趋势，严重危害养禽业的发展。ORT与里默氏菌属相似，为rRNA超家族V科的一个新属，该菌从A～R有18个血清型，常见的为A、B、C和D型，不同血清型的菌株毒力有差异，高致病性菌株如A型和B型，主要引起鸡发生临床疾病，且广泛流行。快速诊断该病是预防和控制ORT病的有效措施之一，对ORT的诊断目前已建立了常规的分离培养、PCR和地高辛标记探针诊断方法。但由于ORT有18个血清型，上述方法需要在事先明确检测目的的情况下，针对某个血清型进行检测，而检测结果仅能判断待检样品是否为该血清型，当待检样品为其他血清型时，无法在一次检测中被鉴定或判断出来。中国专利申请CN201310340100.4公开了通过筛选ORT高血凝活性菌株，培养、洗涤制备ORT血凝抗原；通过采集绵羊血液，洗涤和离心方法制备绵羊红细胞，用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制备醛化绵羊红细胞；通过ORT菌悬多次免疫鸡，采血离心制备ORT标准阳性血清；将制备的ORT血凝抗原、醛化绵羊红细胞和ORT标准阳性血清组装建立鸡鼻气管鸟杆菌血凝抑制抗体检测试剂盒。但其在制备抗体过程中使用保藏编号为CCTCCNo：M2013318的鸡鼻气管鸟杆菌制作ORT血凝抗原，血凝试验敏感性低，加之ORT血清型有18个之多，通过单一菌株实现对不同血清型的抗体进行检测，难度非常大。因此，亟需提供一种高通量、高特异性、高灵敏度的检测鸡体内的ORT抗体水平的检测试剂盒。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒及其制备方法与应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒，可高通量、高特异性检测鸡体内的ORT抗体水平的检测试剂盒。所述试剂盒包括：包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体、酶标抗体、鼻气管鸟杆菌阴性对照血清和阳性对照血清；所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管炎鸟杆菌。脂多糖(Lipopolysacchride，LPS)是脂质双层向细胞外伸出，包括类脂A、核心多糖、特异性多糖。类脂A为一种糖磷脂，为革兰氏阴性菌的致病物质，无种属特异性，可做为广谱抗原建立检测方法；核心多糖位于类脂的外层，具有属的特异性，同一属细菌的核心多糖相同；特异性多糖在脂多糖的最外层，是革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原)，是决定细菌抗原特异性的成分。因此，以LPS为包被抗原建立通用型检测方法，可以最大程度地保证检测方法的特异性、敏感性和通用性，并且LPS抗原制备简单，能够很好地保证所制备抗原的均一性。若以其它膜蛋白为靶抗原建立检测方法，抗原制备工艺复杂，检测方法的通用性、敏感性将会有很大程度的降低，仅适合用于单一血清型抗体检测方法的建立。其中，所述鼻气管鸟杆菌脂多糖的制备方法为：(1)将B型鼻气管炎鸟杆菌菌株活化，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养，转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养；(2)获取菌体培养物，离心，使用PBS重悬菌体沉淀；(3)向重悬菌体中加入裂解缓冲液，加入氯仿，室温孵育，离心取上清，加入纯化裂解液，混匀孵育，离心，洗涤，干燥后加入Tris-HCL，即得。进一步地，所述包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体的制备方法为：(1)向微孔板的每孔加入含43±5ug/mlB型ORT抗原的包被液，4℃过夜包被10-16h；(2)每孔加洗涤液进行洗板；(3)向微孔板的每孔加入封闭液进行封闭；(4)将微孔板放入恒温恒湿箱，37℃放置2h。其中，所述封闭液优选为NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，胎牛血清100mL，蔗糖30g，明胶2.0g，酪蛋白2.0g，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。使用本专利技术所述的封闭液，可使ORT阴性对照及阴性血清OD值显著降低，消除样品中非特异性IgG结合微孔板底的干扰，较好的起到了封闭微孔板底空白位点的作用，4℃放置6个月稳定不沉底不变质。进一步地，所述试剂盒中的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG。能更进一步的，所述试剂盒还包括：洗涤缓冲液、样本稀释缓冲液、显色液、终止液和底物液。所述洗涤缓冲液为：NaCl80g，KCl2g，Na2HPO4·12H2O29g，KH2PO42g，吐温-2010ml，加纯水定容至5L；所述样本稀释缓冲液为：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，吐温-208ml，甘油6ml，马血清50ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。通过对比本专利技术所述样本稀释缓冲液与PBS后发现，使用本专利技术所述样本稀释缓冲液的ORT阴性对照及阴性血清OD值显著降低，与巴氏杆菌、大肠杆菌O78、鸡毒支原体、副鸡嗜血杆菌、传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、减蛋综合征病毒、禽流感H9N2和H5N1亚型病毒抗体，降低了非特异性结合，消除假阳性的作用。稳定性试验显示4℃放置6个月稳定不沉底不变质；用样本稀释缓冲液稀释阳性对照至工作浓度，加速破坏性试验显示37℃处理9dOD值降低30％以内。进一步优选，所述酶标抗体在应用时，使用酶标抗体稀释液对其进行稀释，所述酶标抗体稀释液为NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，甘油10ml，马血清100ml，酪蛋白3g，蔗糖1.5g，TritonX-1002.5ml，硫柳汞0.03g，加纯水定容至1L。使用本专利技术所述酶标抗体稀释液稀释酶标结合物至工作浓度，经稳定性试验显示4℃放置6个月稳定不沉底不变质，加速破坏性试验显示37℃处理9d灵敏度降低25％以内。本专利技术还提供了鼻气管鸟杆菌脂多糖在制备特异性检测鼻气管鸟杆菌抗体试剂或试剂盒中的应用，所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管鸟杆菌。进一步地，本专利技术提供所述试剂盒的使用方法，具体如下：(1)在A1和A2孔中分别加入100μl阴性对照；在A3和A4孔中分别加入100μl阳性对照；(2)取100μl经1：40稀释好的待检样品液加入相应孔中，并做好记录；37℃孵育30min；(3)将各孔的液体弃入废液桶，每孔加300μl的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s；(4)每孔加100μl酶标结合物；37℃孵育30min；(5)重复步骤(3)；(6)每孔加100μl底物液；(7)室温(15℃-26℃)避光显色孵育10min；(8)每孔加100μl的终止液；立刻于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450nm值；(9)临界值(C.O.)的计算正常情况下，阳性对照孔OD450值≥0.4；阴性对照孔OD450值≤0.2；阴性对照孔OD45本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体、酶标抗体、鼻气管鸟杆菌阴性对照血清和阳性对照血清；所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管炎鸟杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种检测鼻气管鸟杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体、酶标抗体、鼻气管鸟杆菌阴性对照血清和阳性对照血清；所述鼻气管鸟杆菌脂多糖来自B型鼻气管炎鸟杆菌。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述鼻气管鸟杆菌脂多糖的制备方法为：(1)将B型鼻气管炎鸟杆菌菌株活化，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养，转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养；(2)获取菌体培养物，离心，使用PBS重悬菌体沉淀；(3)向重悬菌体中加入裂解缓冲液，加入氯仿，室温孵育，离心取上清，加入纯化裂解液，混匀孵育，离心，洗涤，干燥后加入Tris-HCL，即得。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有鼻气管鸟杆菌脂多糖的固相载体的制备方法为：(1)向微孔板的每孔加入含43±5ug/mlB型ORT抗原的包被液，4℃过夜包被10-16h；(2)每孔加洗涤液进行洗板；(3)向微孔板的每孔加入封闭液进行封闭；(4)将微孔板放入恒温恒湿箱，37℃放置2h。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：何诚，王金良，沈志强，苗立中，
申请(专利权)人：何诚，王金良，沈志强，曲光刚，苗立中，
类型：发明
国别省市：北京,11