一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。本发明专利技术使用HRP标记兔抗IgG，替代传统ELISA中的一抗和二抗，简化了操作步骤。同时通过改变包被稳定工艺将SVV豚鼠抗IgG包被到固相载体表面，改变了酶标抗体稀释液的配制工艺，可使酶标抗体工作液稳定保存而不改变其活性和效价，建立了特异检测SVV抗原的双抗夹心ELISA试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的提出弥补了SVV ELISA抗原检测的空缺，克服了现有病毒分离检测SVV抗原重复性和敏感性低、操作程序繁琐的问题，为SVV抗原检测提供了一种有效的技术手段。

A method for detecting a Seneca virus antigen sandwich ELISA kit and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，特别涉及基于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)特异性酶标抗体技术建立的用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。本专利技术属于生物检测

技术介绍
SVV也被称为塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)，其对美国猪群来说并不陌生。在过去30年中，共有近20例SVV感染被确认。在美国，SVV通常与特发性猪水疱病有关。在全球范围内都有SVA的报道，包括加拿大、澳大利亚、意大利、新西兰和巴西。SVV是一种无囊膜、单链RNA病毒，与猪口蹄疫(FMD)和猪水疱病毒一样，属小RNA病毒科。它可能是猪特发性水疱病的病原体，但是这种观点尚未得到证实。2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡，PCR检测排除FMDV、PDCoV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、A/B/C型猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV)的感染，发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为SVV阳性，并通过猪睾丸细胞(ST细胞)分离得到SVV。2015年3月，我国广东某猪场超期断奶猪被发现跛行，将发情母猪赶去配种舍定位栏冲洗干净后，发现一头猪出现鼻镜水泡，送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示口蹄疫、猪水疱病病原检测均阴性而猪场的发病仍在扩大，最终通过对病料进行多种病原的检测送测序后获得一段序列，经与基因数据库比对，发现与SVV序列的相似性最高，继而查找资料，确定发病猪群感染SVV，并分离到SVV细胞株。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其他猪场发现猪群感染SVV病例，而且一直呈现上升趋势。由于SVV感染动物所引起的症状与其他病毒性疾病如口蹄疫、水泡性口炎病、猪水疱病临床表现十分相似，给临床确诊带来了难度。因此，需要实验室技术加以确定。目前主要包括病毒分离、抗体检测和抗原检测等。抗体检测方法主要包括血清中和试验(特异性高，广泛应用于血清学调查)和ELISA法(适用于猪血清大规模普查)。病原学检测方法主要是免疫组化试验，该方法是抗原检测敏感且特异的方法，主要体现在能定位病原在组织细胞中的分布。RT-PCR技术通常具有特异性高、可靠、快速，广泛应用于分子生物学检测。目前应用于SVV诊断的检测方法程序繁多、操作步骤复杂，检测至少需要一天的时间才能获得结果，因此在疫情突发时无法实现大量的样品的即时检测。要克服现状就必须研制新型ELISA诊断技术，本专利技术所涉及的检测方法是以轻简化或精准为目标的新型定性定量技术。另外，鉴于目前国内外尚未有血清学诊断方法的报道，唯一能检测抗原的方法为病毒分离，本方法属于首创SVV抗原检测的ELISA试剂盒，相对于病毒分离而言，本专利技术具有简便、敏感、稳定及省时等特点，为SVV抗原检测提供了一种有效的技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种用于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其中包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，所述的酶标板按照以下方法制备得到：(1)获得SVV豚鼠高免血清；(2)离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG；(5)SVV豚鼠抗IgG的包被将制备的高纯度的SVV豚鼠抗血清IgG用pH7.2的碳酸盐缓冲液按照体积比1:3000进行稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl稀释后的SVV豚鼠抗IgG，4℃静置8～12小时；(6)酶标反应板稳定剂的配制将5gBSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/LPBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用；(7)酶标反应板的封闭方法弃去酶标板孔内的SVV豚鼠抗IgG稀释液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板；之后按150μl/孔的量加入步骤(6)制备得到的酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板，用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到：(1)获得SVV高免兔血清；(2)离心去除SVV高免兔血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV兔抗IgG；(5)HRP标记SVV兔抗IgG的制备将纯化之后的5mg/mL的SVV兔抗IgG0.3mL与0.1mL过氧化物酶加入1.5mL的EP管中，轻轻吹打混匀，4℃过夜；向混合物中加入40μL的三乙醇胺，混匀，加入50μL的硼氢化钠，混匀，4℃放置30min，再次加入10μL甘氨酸溶液，混匀，之后将混合液置于透析袋中透析，所用的透析液为pH7.2的PBS缓冲液。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，还包括洗涤液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、阳性对照、阴性对照、显色液以及终止液。其中，优选的，所述的洗涤液是含有5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢钾的水溶液，pH7.4，使用时稀释10倍使用；所述的样品稀释液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％Tween-20、8w/w％氯化钠、0.2w/w％氯化钾、2.9w/w％磷酸氢二钠和0.2w/w％磷酸二氢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。

【技术特征摘要】
1.一种用于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标板按照以下方法制备得到：(1)获得SVV豚鼠高免血清；(2)离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG；(5)SVV豚鼠抗IgG的包被将制备的高纯度SVV豚鼠抗IgG用pH7.2的碳酸盐缓冲液按照体积比1:3000进行稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl稀释后的SVV豚鼠抗IgG，4℃静置8～12小时；(6)酶标反应板稳定剂的配制将5gBSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/LPBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用；(7)酶标反应板的封闭方法弃去酶标板孔内的SVV豚鼠抗IgG稀释液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板；之后按150μl/孔的量加入步骤(6)制备得到的酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板，用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到：(1)获得SVV高免兔血清；(2)离心去除SVV高免兔血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，田宏，杨帆，石正旺，刘华南，张克山，朱紫祥，李丹，刘永杰，何继军，郭建宏，蒋韬，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62