一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。本发明专利技术使用HRP标记兔抗IgG，替代传统ELISA中的一抗和二抗，简化了操作步骤。同时通过改变包被稳定工艺将SVV豚鼠抗IgG包被到固相载体表面，改变了酶标抗体稀释液的配制工艺，可使酶标抗体工作液稳定保存而不改变其活性和效价，建立了特异检测SVV抗原的双抗夹心ELISA试剂盒及其检测方法。本发明专利技术的提出弥补了SVV ELISA抗原检测的空缺，克服了现有病毒分离检测SVV抗原重复性和敏感性低、操作程序繁琐的问题，为SVV抗原检测提供了一种有效的技术手段。

A method for detecting a Seneca virus antigen sandwich ELISA kit and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，特别涉及基于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)特异性酶标抗体技术建立的用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒及其应用。本专利技术属于生物检测

技术介绍
SVV也被称为塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)，其对美国猪群来说并不陌生。在过去30年中，共有近20例SVV感染被确认。在美国，SVV通常与特发性猪水疱病有关。在全球范围内都有SVA的报道，包括加拿大、澳大利亚、意大利、新西兰和巴西。SVV是一种无囊膜、单链RNA病毒，与猪口蹄疫(FMD)和猪水疱病毒一样，属小RNA病毒科。它可能是猪特发性水疱病的病原体，但是这种观点尚未得到证实。2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡，PCR检测排除FMDV、PDCoV、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、A/B/C型猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV)的感染，发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于塞内卡病毒(Seneca Valleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。

【技术特征摘要】
1.一种用于塞内卡病毒(SenecaValleyvirus,SVV)抗原检测的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于包括塞内卡病毒豚鼠抗IgG包被的酶标板以及HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标板按照以下方法制备得到：(1)获得SVV豚鼠高免血清；(2)离心去除SVV豚鼠高免血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积的Na3PO3缓冲液洗涤，最后用2～5倍柱体积的0.1M，pH2.7的Glycine-HCl洗脱，收集洗脱液，4℃透析浓缩，得到高纯度SVV豚鼠抗IgG；(5)SVV豚鼠抗IgG的包被将制备的高纯度SVV豚鼠抗IgG用pH7.2的碳酸盐缓冲液按照体积比1:3000进行稀释，之后在ELISA板的每孔加50μl稀释后的SVV豚鼠抗IgG，4℃静置8～12小时；(6)酶标反应板稳定剂的配制将5gBSA、10g蔗糖、20g海藻糖，加入到1000ml0.01mol/LPBS(pH7.4)中轻轻震荡至溶解，加0.05w/v％Procline300，保存于4℃备用；(7)酶标反应板的封闭方法弃去酶标板孔内的SVV豚鼠抗IgG稀释液，加入洗涤液，室温下振荡洗涤2分钟，甩掉洗涤液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡，同法重复洗涤3次，甩干酶标板；之后按150μl/孔的量加入步骤(6)制备得到的酶标反应板稳定剂，4℃过夜，弃去稳定剂，拍干并置通风厨中吹干酶标板，用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，HRP标记的塞内卡病毒兔抗IgG按照以下方法制备得到：(1)获得SVV高免兔血清；(2)离心去除SVV高免兔血清的沉淀，之后每10ml血清加入1ml1mol/LCaCl2溶液和0.4ml5w/v％的硫酸葡聚糖溶液，室温搅拌15分钟，12000r/min，4℃离心20分钟，收集上清液；(3)向步骤(2)得到的上清液中加入等体积饱和硫酸铵溶液，混匀后于4℃静置4～6小时，离心弃上清，用0.01mol/L、pH7.4PBS溶解沉淀，透析去除硫酸铵；(4)先用10倍柱体积的0.02mol/L，pH7.0的Na3PO3缓冲液洗亲和层析柱，然后用注射器以1ml/min速度加入步骤(3)透析后的样品，再以5～10倍柱体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，田宏，杨帆，石正旺，刘华南，张克山，朱紫祥，李丹，刘永杰，何继军，郭建宏，蒋韬，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62