重组因子Ⅷ在无蛋白培养基中的制备制造技术

在无任何动物来源蛋白如清蛋白存在时通过在补充以多元醇共聚物，优选在微量金属如铜存在下的无蛋白培养基中培养细胞可连续地从哺乳动物细胞中制备相对大量的重组因子Ⅷ。在优选的实施方案中，培养基包括称为ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８的多元醇、硫酸铜、硫酸亚铁／ＥＤＴＡ复合物及微量金属如锰、钼、硅、锂和铬的盐。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
领域本专利技术一般地涉及重组因子Ⅷ的制备并且特别地涉及在血清或无蛋白培养基中重组因子Ⅷ的制备。
技术介绍
血友病A是X-连锁的隐性遗传病，它是由于因子Ⅷ分子有缺陷或不足的而导致的出血倾向。为控制出血，可以用因子Ⅷ治疗血友病。在历史上因子Ⅷ从人类血浆中加以分离。然而，从血浆来源的因子Ⅷ的治疗伴随多种人类病毒，如肝类和人类免疫缺陷病毒的传播。随着重组DNA技术的问世，人类因子Ⅷ及其基因的结构已被阐明。源自26个外显子的该基因转录产物为约9000个碱基长度的信使RNA分子，其编码一个2351个氨基酸的大型蛋白。对因子Ⅷ的结构研究显示其为含有较多碳水化合物残基的糖蛋白。编码因子Ⅷ的cDNA己被克隆并在幼年仓鼠肾(BHK-21)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中稳定表达。已开发出商业方法以制备用于治疗血友病A的重组因子Ⅷ。现在通过遗传工程的哺乳动物细胞制备重组因子Ⅷ，因此，避免了依赖血浆并且使病毒传播的可能风险降为最低。基因扩增已成为获得高产量治疗蛋白细胞系的首选方法。扩增策略包括将编码所需蛋白的转录与可扩增的标记如二氢叶酸还原酶相连接。然后应用转染技术将载体DNA转入受体细胞。筛选对选择药物如氨甲蝶呤具有增强抗性的细胞种群。通过限制性稀释克隆完成建立稳定的细胞克隆。然后将这些细胞克隆适应于无血清的制备培养基并检测所需蛋白的产量。对于不稳定的蛋白如因子Ⅷ，在制备和纯化步骤中加入人类清蛋白作为稳定剂。虽然清蛋白通过巴斯德消毒加以病毒灭活，但是如果重组因子Ⅷ可在完全没有人类及动物血液蛋白存在时制备将是理想的。我现在发现通过用一种新的细胞培养基这是可能的。详述如下。在没有任何人类或动物来源血浆蛋白时从哺乳动物细胞中连续制备相对大量的重组因子Ⅷ(rFⅧ)的方法包括在补充以如Pluronic F-68的多元醇(polyo1)聚合物的无蛋白培养基中培养哺乳动物宿主细胞。优选的培养基包括硫酸铜、硫酸亚铁/EDTA复合物及微量金属盐如锰、钼、硅、锂、及铬。重组蛋白表达技术的最新进展已使在哺乳动物细胞中大量制备蛋白成为可能。适于因子Ⅷ制备的宿主细胞包括细胞系如幼年仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和人类胚胎肾(HEK)细胞。特别优选的为幼年仓鼠肾细胞，特别是那些以能够按Wood等(1984)所述介导因子Ⅷ表达的基因转染的那些细胞。这些细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)中并己得到许可号ATCC CRL-8544。带有因子Ⅷ基因的所需的宿主细胞系一般适于在补充以脂蛋白的无蛋白制备培养基中作为悬浮培养物而培养。选择用于培养宿主细胞系的基本培养基对本专利技术并非至关重要的并且可以是任何一种本领域众所周知的适于培养哺乳动物细胞的培养基或其组合。商业上可得到的培养基如Dulbecco’sModified Eagle培养基，Ham’s培养基F-2,Eagle’s基本培养基，及RPMI-1640培养基等。在本领域中添加生长因子加重组胰岛素是常见的。由于因子Ⅷ的不稳定性质，工程宿主细胞产率在无蛋白条件下严重下降。人类血清蛋白常用作重组蛋白制备的无血清培养添加剂。人类血清蛋的具有多种功能，包括(1)作为脂肪酸、胆固醇和亲脂维生素、类固醇激素及生长因子的载体；(2)作为抵御剪切力损伤的保护剂；(3)作为pH变化的缓冲剂；及(4)作为渗透压调节剂。血清蛋白另一至关重要的作用或许是通过用作蛋白酶的底物而保护不稳定的蛋白如因子Ⅷ免受蛋白水解。存在于血清制品中的不纯物也可有利于清蛋白的稳定效应。已鉴定出因子如脂蛋白(Chan,1996)作为在无血清条件下用于制备重组因子Ⅷ的人类血清蛋白的替代品。我们的开发人类血浆来源清蛋白的制备培养基的尝试导致了本公开的专利技术，即用于重组因子Ⅷ制备的无蛋白基本培养基。优选的培养基由修改的Dulbeceo’s基本培养基(Minimum Essential Medium)和补充以10μg/ml重组胰岛素(Nucellin,Eli Lillg)及FeSO4·EDTA(50μM)的Ham’s F-12培养基所组成(50∶50重量比)。除了因子Ⅷ的制备以外，工程BHK细胞在此无蛋白基本培养基中生长良好。令人惊奇的是，添加多元醇(polyol)如Pluronic F-68对生长没有影响但增强了BHK细胞因子Ⅷ的特异产率。令人神奇的是，添加硫酸铜进一步增强了因子Ⅷ的产生。包括一组微量金属如锰、钼、硅、锂、及铬也导致因子Ⅷ产量的进一步增加。然后开发出用于在无人类血浆来源蛋白条件下因子Ⅷ制备的连续方法。关于Pluronic多元醇(polyols)使用的进一步信息可见于Papoutsakis(1997)及Schmolka(1977)。Pluronic F-68，一种聚二醇(polyglycol),(BASF,Wyandot)常用于防止在搅拌的培养物中出现的泡沫形成，并用于保护细胞免受剪切力及少数培养物中水泡的损害。Pluronic F-68为非离子性的嵌段共聚物(blockcopolymer)，平均分子量为8400，在两端由聚氧丙烯poly(oxypropylene)中心嵌段(20％重量)和聚氧乙烯poly(oxyethylene)嵌段所组成。对PluronicF-68作用的广泛研究表明Pluronic F-68作为表面活性剂而起作用并通过让细胞避开搅拌或混匀(sparging)过程中生物反应器中形成的水泡而防止对细胞的损害。然而，多位研究者已注意到在剪切力最小培养条件下PluronicF-68对生长的有利影响(Mizrahi,1975；Murhammer和Goochee,1990)。在产品纯化过程中从Pluronic F-68对脂类的共纯化提供奇特的证据，即Pluronic聚体不仅可替代清蛋白作为表面活性剂，而且还可作为脂类的载体而起作用。Pluronic F-68也可能通过直接插入到膜中而可在修复完成之前防止膜损害杀死细胞。Pluronic F-68在作为金属离子缓冲剂而起作用过程中的作用完全未知。尽管有培养基中的Pluronic F-68可增加容积产率的报导，其作用机制似乎是维持细胞生存力(Schneidet,1989；Qi,1996)。据我们所知，已见到Pluronic F-68增加特定蛋白产品特异性产量尚属首次。由于在我们的系统中具有和不具有Pluronic F-68时生存力和生长速率是相似的，所以在我们的系统中维持细胞生存力不会是Pluronic F-68的作用机制。然而，无论什么机制，Pluronic F-68添加的效应是直接而巨大的。预计其它多元醇(Polyols)系统将具有类似的效应。这种其它多元醇(Polyols)包括具有约1000至约16,000分子量的非离子聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。除了常规的悬浮培养技术如摇瓶，旋转瓶及滚动瓶外，本专利技术方法也可用于灌流及分批生物反应器。培养宿主细胞后，通过常规的方法如超滤或离心可从消耗的培养基中回收因子Ⅷ。如果需要，回收的因子Ⅷ可通过，例如，离子交换或大小排阻层析、免疫亲和或金属螯合层析加以纯化。如这里所使用的，“无人类或动物蛋白的培养基”为无任何人类来源或动物来源蛋白的细胞培养基。从人类或动物来源分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从带有重组因子Ⅷ基因的哺乳动物细胞中制备重组因子Ⅷ的方法，包括在补充以多元醇的无人类或动物蛋白的培养基中培养所述的哺乳动物宿主细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈深源，K哈里斯，
申请(专利权)人：美国拜尔公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]