香蕉果实中特异表达基因的启动子制造技术

本发明专利技术提供了采用基因组ＤＮＡ步行法克隆的香蕉果实特异性ＡＣＣ合酶基因启动子的序列；包含所述的ＤＮＡ序列与ＧＵＳ报告基因的融合基因构建体；用所产生的构建体转化香蕉的不同器官，瞬时表达结果证明ＧＵＳ报告基因在果实中特异地表达。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物分子生物学和植物基因工程领域。具体地讲，是关于从香蕉基因组DNA获得的一个基因启动子序列，以及利用此启动子来调控嵌合基因在植物中的表达。本专利技术涉及植物基因启动子结构与功能和利用其调控目的基因在植物组织中的表达；具体而言，此启动子DNA序列与目的基因融合构建成植物重组表达载体，以此表达载体转化植物，产生由这一启动子DNA序列驱动的、转录目的基因的转基因植物。植物基因的表达与其它真核生物一样是在DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平等多个层次上进行调控的。从效果来看，转录水平上的调控是最经济有效的。因此转录调控是控制植物基因表达的最重要方式。对拟南芥部分基因组序列的分析显示，大约15％的基因是与转录有关的(Bevan et al.,Nature 391:485-488,1998)。基因启动子通常是指基因中转录起始位点之前控制基因表达的区域。靠近转录起始位点的近端区构成所谓的“核心启动子区”(corepromoter region)；其中通常含有TATA盒和CCAAT盒序列，以及转录起始位点。核心启动子区通常与普遍性转录因子(general transcriptionfactors)如RNA聚合酶Ⅱ，转录因子TFⅡA,TFⅡB,TFⅡD,TFⅡE,TFⅡF和TFⅡH，以及一些辅助蛋白质结合，形成转录起始复合物。在核心启动子区的上游是基因表达的调控序列，是增强体形成的主要部位；调控序列决定着基因表达的水平，表达的时间与空间方式，以及基因的诱导表达方式。对于植物的遗传操作，可以通过目的基因在植物组织中的表达来改变或改进植物的某些表型特征。因此这样的遗传操作依赖于可靠的手段来驱动和控制所需基因的表达；例如利用合适的启动子来控制目的基因在转基因植物中的表达，期望达到我们所预期的效果。为了这一目的，获得更多种类的基因启动子为在植物的遗传操作过程当中有更多的选择手段提供了条件。在驱动基因在植物果实中表达的启动子中，研究得较深入的有番茄E4启动子(Montgomery et al.,Plant Cell 5:1049-1062,1993；Montgomeryet al.,Proc Natl Acad Sci USA 90:5939-5943,1993；Itzhaki et al.,Proc NatlAcad Sci USA 91:8925-8929,1994；Xu et al.,Plant Mol Biol 31:1117-1127,1996)，E8启动子(Deikman ＆ Fisher,EMBO J 7:3315-3320,1988；Deikman et al.,Plant Mol Biol 37:1001-1011,1998)，番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因启动子(Bird et al.,Plant Mol Biol 11:651-662,1988；Nicholass et al.,Plant Mol Biol 28:423-435,1995)和2A11启动子(Pear etal.,Plant Mol Biol 13:639-651,1989；Van Haaren & Houck,Plant Mol Biol21:625-640,1993)；苹果的果实成熟特异性ACC氧化酶基因启动子及其PG基因启动子(Atkinson et al.,Plant Mol Biol 38:449-460,1998)。这些启动子虽然能驱动基因在植物果实中表达，但它们彼此间相似性却很小，其中含有一些特异性较高的序列和顺式作用元件序列；如E4/E8位点，其一致序列为ATT-C-A---A-AGAAA；E4、E8启动子中乙烯应答元件区序列A-A-GAG-AAAATG-----TGAGAGA-A-AAA-GAGA苹果ACC氧化酶基因启动子中乙烯应答增强子序列ATTTCAAA和乙烯应答元件序列TAAGAGGCGCA。在植物果实发育、成熟相关基因启动子中，有些顺式作用元件与果实器官特异性有关，有些顺式作用元件参与乙烯应答反应的调控，可以看出植物果实相关基因的转录也是以组合控制的方式调控的。目前对于果实中表达基因启动子的研究主要集中于双子叶植物当中，单子叶植物果实表达基因启动子的研究还未见有报道。香蕉是一种多年生的大型单子叶草本植物，主要是用来自香蕉不定芽的组培苗来进行生产。香蕉果实不仅是一种人们所喜爱的水果，在某些地区也是当地居民的主要食物。香蕉是进行果实发育、成熟相关启动子研究及进行果实品质改良的适宜单子叶作物。对于香蕉果实相关基因启动子的研究，可以将香蕉作为生物反应器，通过遗传操作手段在其果实中进行口服疫苗等目的蛋白质的生产。本专利技术所基于的工作是分离香蕉果实中特异表达的ACC合酶基因的启动子DNA序列并对其进行序列分析。ACC是1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)的英文缩写。ACC是植物激素乙烯生物合成途径中的中间产物，是由ACC合酶催化合成的。乙烯的生物合成途径已被阐明(Yang & Hoffman,Annu Rev Plant Physiol 35:155-189,1984)；其中乙烯生物合成的最后过程为甲硫氨酸→s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)→1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)→乙烯ACC合酶是催化由S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)生成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)这一步反应的。ACC合酶基因在植物基因组中是以多基因家族的方式存在。在植物的不同器官、组织，不同发育阶段或不同外界因素的作用下，不同的ACC合酶多基因家族的成员表达，以合成植物生长发育以及对外部刺激做出反应所需要的乙烯来调控其它相关基因的表达。香蕉属于呼吸跃变型果实成熟的植物，乙烯在其果实成熟过程中起着极其重要的作用，因而在香蕉果实成熟过程中必将有乙烯合成相关酶的产生，如ACC合酶。本专利技术所提供的DNA序列，见附附图说明图1所示，编码的是一个香蕉ACC合酶基因启动子。其序列从+74至-2505或与之相关的有活性的变体具有指导基因在植物中表达的能力。“有活性的变体”是指与附图1所示序列部分同源或与之相关的片段，并且其具有启动子的活性；可以通过遗传操作来改变此启动子的活性水平或功能特征；譬如，改变关键调控区的核苷酸序列，或使用该启动子截短的或内部缺失的序列，或此启动子的区段与其它启动子的区段连接所形成的嵌合启动子结构。在附图1所示香蕉ACC合酶基因启动子中+75至+77为翻译起始密码子，推测的TATA盒与CCAAT盒分别位于-34至-28与-152至-147的区段上。此启动子序列还未见有相关的报道和阐述。本专利技术的启动子区或其变体适于与任何目的基因融合，所形成的构建物转入植物当中使目的基因在植物细胞中表达。本专利技术所阐明的香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区可以作为一个启动子序列插在重组基因构建物中而用于植物的转化。在这一植物基因表达构建物当中，启动子区具有本专利技术所示的序列或任何与之相关的有启动子活性的变体。它所连接的是除了以天然形式存在的此香蕉ACC合酶基因以外的任何目的基因序列；目的基因的DNA序列可以来自同源植物、外源植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新克隆的香蕉ＡＣＣ合酶基因启动子，其特征在于具有下列基因启动子的核苷酸－２５０５至＋８６的２５９１ｂｐ序列，具有驱动外源基因特异表达的功能。－２５０５ ＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴ ＴＧＴＧＣＴＣＧＧＡ ＧＡＴＧＡＣＧＧＣＡ ＴＧＧＣＴ ＡＡＧＣＴ ＧＣＴＴＣＣＣＣＧＡ－２４５５ ＧＣＡＣＡＧＴＡＴＣ ＡＧＣＣＧＣＡＡＧＧ ＡＧＡＣＣＡＧＴＣＧ ＣＡＣＴＴＧＣＡＧＣ ＡＡＧＣＡＣＧＧＣＣ－２４０５ ＴＣＡＣＡＴＴＴＴＧ ＣＡＣＧＡＧＧＧＣＣ ＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡ Ｇ ＣＧＧＣＴＣＣＧＡ ＴＣＣＡＣＧＡＡＧＧ－２３５５ ＴＣＴＣＡＧＴＧＴＴ ＴＧＡＴＣＡＣＡＡＣ ＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴ ＣＴＧＴＣＡＡＡＧＣ ＴＴＴＧＡＣＣＴＣＣ－２３０５ ＣＣＡＣＴＡＣＡＡＴ ＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴ ＴＧＴＴＣＴＧＴ ＴＣ ＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣ ＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴ－２２５５ ＣＴＧＧＣＣＣＧＧＣ ＣＡＧＧＡＡＧＣＧＴ ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡ ＴＡＣＧＣＣＴＴＴＧ ＡＴＣＴＴＴＧＡＴＴ－２２０５ ＣＣＴＴＧＣＴＡＴＣ ＣＡＴＴＡＡＣＡＡＣ ＴＣＡＧ ＴＡＣＡＣＡ ＡＴＣＴＧＧＴＧＡＡ ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣ－２１５５ ＣＧＣＴＧＧＴＧＧＴ ＴＣＴＣＡＴＣＣＡＡ ＡＴＣＴＣＧＧＣＡＧ ＡＴＡＣＡＡＣＡＴＧ ＡＴＡＧＴＡＴＣＴＴ－２１０５ ＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ ＴＡＧＣＣＡＣＡＴＣ ＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴ ＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡ ＣＧＣＧＡＣＴＣＣＧ －２０５５ ＴＧＴＴＣＧＣＧＣＧ ＴＡＴＡＡＣＡＴＣＧ ＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡ ＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡ ＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧ－２００５ ＡＡＴＧＴＴＴＴＣＴ ＧＣＧＡＡＧ ＡＡＣＡ ＣＧＧＣＣＡＴＧＡＡ ＡＧＣＴＴＴＣＴＣＧ ＴＧＧＡＣＧＴＣＧＣ－１９５５ ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣ ＧＴＧＡＧＧＡＡＣＡ ＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣ ＣＧＴＡＧＴＴＴＡＧ ＣＡＧＧＡＡＴＧＧＧ－１９０５ ＴＴＴＣＡＣＧＧＡＴ ＣＣ ＧＡＣＧＡＴＧＧ ＣＡＣＣＧＡＧＡＡＣ ＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡ ＡＴＧＧＧＧＡＴＧＴ－１８５５ ＣＣＡＡＴＣＴＡＡＡ ＡＣＧＴＴＧＣＣＧＡ ＣＡＴＣＴＴＡＡＴＣ ＧＴＧＣＣＴＧＡＧＡ ＴＣＡＴＡＴＡＴＴＡ－１８０５ ＣＣＴＡＣＡＡＡＣ Ａ ＣＡＣＧＴＴＡＴＴＴ ＡＴＴＣＴＧＧＣＴＴ ＴＣＡＧＴＧＧＡＡＴ ＡＡＴＴＡＣＴＣＴＴ－１７５５ ＴＡＣＴＴＴＣＴＴＴ Ｇ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王新力，彭学贤，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]