培养基中添加茉莉酮酸类化合物的三七细胞培养方法技术

本发明专利技术公开了一种在培养基中添加茉莉酮（酸）类化合物的三七细胞培养方法。通过在培养基中添加茉莉酮（酸）类化合物，不但促进了总皂甙的合成，更重要的是改变了各单体皂甙之间的比例，成功实现了对单体皂甙合成的调控，为定向单体皂甙的大规模商业生产奠定了基础。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种三七细胞培养方法，特别涉及一种在培养基中添加了能够调控人参皂甙成分的物质的培养方法。
技术介绍
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又称田七、三七参、人参三七等，为五加科人参属植物，主要分布于我国西南部的云南、广西等地。《本草纲目》中载有其药用功效，如活血化瘀、镇定止痛、止血补血和滋补强壮等功效，现代医学研究揭示了三萜类人参皂甙是其主要生物活性成分之一。人参皂甙并非单一成分，它们种类多，根据其甙元的不同可分为达玛烷型四环三萜皂甙和齐墩果烷型五环三萜皂甙(如Ro)。已经证明达玛烷型四环三萜皂甙比齐墩果烷型五环三萜皂甙具有更强的生物活性，它们又分为Rb组(甙元为原人参二醇，如Rb1、Rb2、Re、Rd、Rh2、Rg3等)和Rg组(甙元为原人参三醇，如Rg1、Rg2、Rg1、Re等)人参皂甙。各人参皂甙单体的生物活性不一、有的甚至相反(郑光植和杨崇仁，1994)。例如，人参皂甙Rb1有抗溶血作用，而Ro具有溶血性质；Rb1、Rb2抑制中枢神经系统，而Rg1兴奋中枢神经(郑光植和杨崇仁，1994)；Rb1还有增强核糖核酸聚合酶的活性，而Re则有抑制核糖核酸聚合酶的活性(王宪楷，1988)。Rd具有增强免疫功能，抑制癌细胞生长的作用，Rh1和Rh2具有促进癌细胞转化的作用。另外，中国第一个中药一类新药——Rg3参一胶囊中的主要成分Rg3具有抑制肿瘤生长、诱导肿瘤细胞调亡和抗肿瘤细胞转移的作用。细胞培养法生产人参皂甙有效成份，由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种更有效的方法。Zheng，G.Z.，Wang，S.L.，Gan，F.Y Studies oncell technology of secondary metabolites from Panax notoginseng.InProceedings ofChina-Japan Symposium on Plant Biotechnology.Shanghai，China.1988，p26-30等报道了人参寡糖素对三七细胞的皂甙含量有促进作用，文献Furuya，Y.，Yoshikawa，T.，Orihara，Y.，Oda，H.Studies of the culture conditions for Panax ginseng cells in jarfermentors.J.Nat.Prod.1984，4770-75报道了溶菌酶能促进人参细胞培养物中皂甙的生物合成，但这些工作多侧重提高总皂甙的含量。并且，近年来的商业化人参产品已经覆盖许多国家，光人参属原材料的年销量已超过10亿美元(Wu和Zhong，1999)，所以利用细胞培养法生产人参皂甙具有较大的市场潜力。由于不同人参皂甙组分的生理活性的差别大，使得总人参皂甙(各单体人参皂甙的混合物)较难显示良好专一的生物活性。并且，如上述，各单体人参皂甙的分子结构非常相似、理化性质也相近，故难以简单把它们分离开来；即使能分离获得，由此也会大大增加生产成本，实用化生产较为困难。因此，对细胞培养过程中各单体皂甙的积累进行调控对于其商业应用具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是公开一种通过在三七细胞发酵培养基中添加茉莉酮(酸)类化合物来调节人参皂甙有效成份的三七细胞培养的方法，在人参单体皂甙组分比例同时增加人参总皂甙含量的技术，以克服现有技术存在的无法调控人参皂甙有效成份的缺陷，为工业化经济生产人参皂甙各单体组份奠定基础。本专利技术的方法包括在文献“Plyant Physiol 15，(1962)473～479”报导的Murashige-Skoog(MS)培养基中添加茉莉酮(酸)类化合物，然后对三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)种子细胞进行培养。每隔10～15天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为50-200rpm，培养温度20-30C，暗培养。所说的三七细胞是由多年生三七植株的根诱导而得，该诱导方法可采用文献“三七生物学及其应用，1994，科学出版社，北京”所报导的技术。所说的茉莉酮(酸)类化合物为具有式(1)(茉莉酮酸类)、(2)(二氢茉莉酮酸类)、(3)(cucurbates)或(4)(茉莉酮)所示结构的化合物及其所有立体异构体和混合物。 式(1)、(2)和(3)中的R是H、卤素、CnH2n+1、CnH2n-1、CnH2nOH或CnH2(n-1)OH中的一种，其中1≤n≤10)。特别优选的是式(1)或(2)所示的化合物；最优选的是式(1)或(2)所示的化合物的R＝H或CH3。培养基中茉莉酮(酸)类化合物的浓度为0.01～1000μM，特别优选的为0.1～500μM。人参单体皂甙的测定是通过高压液相色谱法(Ren and Chen，1999)。采用上述方法所获得的人参皂甙的有效成份，采用上述方法进行测试，结果表明本专利技术的方法可实现对三七细胞培养生产人参皂甙的单体皂甙合成的调控。实验所用三七细胞在普通的对照培养基中生长，可检测的单体皂甙有Rg1、Re和Rb1，其各含量没有明显差别。通过茉莉酮(酸)类化合物特别是甲基茉莉酮酸酯(结构(1)，其中R＝CH3)的添加，单体皂甙的含量比例发生了显著的变化，Rb组人参皂甙、尤其是Rb1的含量相对于其它单体有显著增加，并且检测到了Rd。如实例2条件D所示，在第15天，与对照相比，添加200μM甲基茉莉酮酸酯后，皂甙含量和比例发生了明显变化，Rb1比对照提高了约8倍，Rg1和Re比对照高1倍左右，并且Rb与Rg组皂甙的含量比例比对照提高了3倍多。这表明在培养基中添加茉莉酮(酸)类化合物，可以调节三七细胞合成单体皂甙组份的多样性。本专利技术通过在三七细胞培养基中添加茉莉酮(酸)类诱导物，不但提高了皂甙的含量，更重要的是改变了单体皂甙的比例，为工业化生产单体皂甙奠定了基础。具体实施例方式实施例1实验采用的是由多年生三七植株的根诱导而得三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)细胞。对照培养采用MS培养基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30/L蔗糖。单体皂甙的调控采用对照培养基同时添加二氢甲基茉莉酮酸酯(具有(2)式的结构，其中R＝CH3)。将2g真空过滤所得湿细胞接种到装有50ml新鲜培养基的250ml三角摇瓶中，25℃暗培养，细胞在40℃干燥后称重。另外，干细胞按照Ren和Chen(Ren and Chen，1999)的方法萃取处理后高效液相色谱分析单体皂甙的含量。结果见下表(培养12天)。二氢甲基茉莉干重 皂甙含量(mg/100ug 干重)Rb∶Rg酮酸酯添加量(g/L) Rg1 ReRb1Total06.86±0.48 0.31±0.02 0.28±0.01 0.39±0.01 0.98±0.04 0.67±0.045μM 6.89±0.47 0.31±0.01 0.27±0.02 0.39±0.01 0.96±0.03 0.67±0.0520μM 7.14±0.05 0.37±0.02 0.34±0.01 0.43±0.03 1.14本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养基中添加茉莉酮（酸）类化合物的三七细胞培养方法，其特征在于，该方法包括在Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ培养基中添加茉莉酮（酸）类化合物，然后对三七（Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ（Ｂｕｒｋ．）Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ）种子细胞进行培 养；所说的茉莉酮（酸）类化合物为具有式（１）（茉莉酮酸类）、（２）（二氢茉莉酮酸类）、（３）（ｃｕｃｕｒｂａｔｅｓ）或（４）（茉莉酮）所示结构的化合物及其所有立体异构体或混合物：＊＊＊式（１）、（２）和（３）中的Ｒ是Ｈ、卤素、Ｃ ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ＋１］、Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ－１］、Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ］ＯＨ或Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２（ｎ－１）］ＯＨ中的一种，其中：１≤ｎ≤１０）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟建江，王威，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]