一种提高多引物RCA特异性的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高多引物RCA特异性的方法，其通过改良商品化多引物RCA试剂盒TempliPhi(Amersham Biosciences)中的各成分含量，替换成市面上容易购买并且价格低廉的2.5mMdNTP，10×BSA，phi29DNA聚合酶buffer。同时在多引物RCA反应过程中加入适当浓度的聚乙二醇(PEG，8000)，可以显著地提高多引物RCA的特异性，填补多引物RCA反应中一直以来难以消减的非特异性扩增产生的拖尾现象。实现了对市售多引物RCA试剂盒的显著优化。

A method to improve the specificity of multiple primer RCA

The invention discloses a method for improving multiple primers specific for RCA, through the improvement of the commercialization of multi primer RCA TempliPhi Kit (Amersham Biosciences) the content of each component in the replacement market, easy to buy and cheap 2.5mMdNTP, 10 * BSA, phi29DNA polymerase buffer. Meanwhile, adding multiple concentrations of polyethylene glycol (PEG, 8000) in multi primers RCA reaction can significantly improve the specificity of multi primers RCA, and fill the tailing phenomenon of non-specific amplification which has been difficult to reduce in multi primer RCA reaction. The remarkable optimization of the multi primer RCA kit for sale was achieved.

【技术实现步骤摘要】
一种提高多引物RCA特异性的方法
本专利技术是基于对商品化多引物RCA试剂盒的改良，涉及一种提高改良多引物RCA特异性的方法。
技术介绍
滚环扩增(Rollingcircleamplification，多引物RCA)是1998年建立的一种体外等温核酸扩增方法。该方法借鉴了环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式，实现环状DNA的高速循环复制。作为一种有效的DNA扩增工具，RCA具有很多的优势。如对设备要求低，操作简单，检测所有感染体中环型DNA成分，不需要知道任何的基因序列信息等特点。目前RCA技术已经被广泛的应用于DNA测序，蛋白质表达，生物传感器，诊断，药物发现和纳米技术等。滚环扩增主要利用了具有稳定性强和链置换活性的DNA聚合酶，如Phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶等。根据寡核苷酸引物的数量和种类，滚环扩增又可分为线性扩增(Linear多引物RCA，L多引物RCA)、指数扩增(Hyperbranched多引物RCA，H多引物RCA)、多引物滚环扩增(multiply-primed多引物RCA)和锁式探针扩增(Ligation-多引物RCA，L多引物RCA)等。其中，多引物RCA主要利用了Phi29DNA聚合酶和引物六聚体，实现对不同的核酸分子进行扩增，如质粒、人工细菌染色体(Bacteriaartificialchromosome,BAC)、粘粒等大的环状DNA等，同时也可以扩增未知序列的环状DNA和无法克隆的环状模板，产物为双链，可用于测序、酶切、克隆、标记和检测等方面，市售的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒即应用了多引物RCA技术。多引物RCA技术已得到广泛应用，但该技术仍存在一定的不足。尤其是当反应体系中的DNA模板复杂或含量很低时，大量引物不能与模板有效配对，引物之间易形成二聚体结构，导致错配的产生，产生大量非特异性扩增产物，降低了目的DNA的滚环扩增效率。这一点，即使我们使用优化过的反应条件(比如：使用修改过的随机引物)，非特异性扩增产物也不能被完全消除，特别是，当多引物RCA体系中不含有或含有少量的DNA，非特异性扩增现象依然存在。目前，据文献报道，有一种利用突变的单链DNA结合蛋白TthSSB来改善多引物RCA扩增的方法。该方法是将突变TthSSB蛋白加入到市售的多引物RCA试剂盒体系中(TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒)，提高了多引物RCA的扩增特异性同时消减了多引物RCA非特异性扩增的现象。因TthSSB蛋白具备单链结合蛋白(single-strandednucleicacidbindingprotein，SSB)的特性，在多引物RCA反应过程中，通过与体系中的单链DNA结合，不仅使得单链DNA保持稳定，防止其重新配对成双链或被核酸酶降解，还能促进同源的核苷酸链互补配对，从而实现了对多引物RCA技术的优化。但是，该文献中没有明确的指出蛋白的用量，同时该方法需要先纯化出有活性的TthSSB蛋白，步骤繁琐、费时费力，价格昂贵，同时不利于运输和保存，在实际应用中相对困难。因此，本申请人对此进行深入研究，旨在开发一种容易应用，简单、廉价、快速、高效的提高多引物RCA扩增特异性的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高多引物RCA特异性的方法，该方法可高效地扩增目标核酸序列。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000溶液，备用；(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ulddH2O中加入1ngpUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；(3)培育：将2ul的2.5mMdNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在此多引物RCA反应液中加入0～1.6ul的所述PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃，得到改良的多引物RCA扩增产物。采用上述方案后，本专利技术的优点在于：其通过改良商品化多引物RCA试剂盒TempliPhi(AmershamBiosciences)中的各成分含量，替换成市面上容易购买并且价格低廉的2.5mMdNTP、10×BSA和phi29DNA聚合酶buffer，得到改良的多引物RCA反应液，然后在改良的多引物RCA反应液中加入一定浓度的PEG8000溶液，可以减少非特异性扩增，显著提高滚环扩增的特异性，填补了多引物RCA反应中一直以来难以克服的非特异性扩增拖尾现象，实现了对市售多引物RCA试剂盒(TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒)的进一步优化。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术在改良的多引物RCA体系中分别加入0.5ul和1ul的PEG8000溶液后与试剂盒多引物RCA对比的电泳检测示意图；图2是本专利技术中不同含量的PEG8000溶液对改良的多引物RCA扩增特异性影响情况的电泳示意图；图3是本专利技术中单酶切鉴定改良的多引物RCA产物质量情况的电泳示意图；图4是本专利技术中PCR鉴定改良的多引物RCA产物质量情况的电泳示意图；图5是本专利技术中不同含量的PEG8000溶液对改良的多引物RCA扩增产物的数据统计图。具体实施方式实施例1：改良多引物RCA体系一种提高多引物RCA特异性的方法，包括以下步骤：(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000(聚乙二醇8000)溶液，备用；(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ulddH2O中加入1ngpUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；其中，重组质粒pUC19-hupB的基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示。(3)培育：将2ul的2.5mMdNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中的Phi29DNA酶混合液(该酶混合液包括Phi29DNA聚合酶和引物六聚体)，混匀，置于冰上，得到预混合酶液；将5ul预混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到多引物RCA反应液；在多引物RCA反应液中加入0～1.6ul的所述PEG8000溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min，冷却至4℃；得到改良的多引物RCA扩增产物。本实施例中，使用AmershamBiosciences公司的TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒，按照试剂盒的说明进行操作作为对照组；并且在本专利技术方法的步骤(3)中，所述PEG8000溶液的用量分别选取0.5ul和1ul，进行效果比较。多引物RCA扩增产物检测：取3ul所述改良的多引物RCA扩增产物以1％(W/V)琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和90V电压下电泳40min，然后在0.5μg/mL溴化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高多引物RCA特异性的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000溶液，备用；(2)变性：以pUC19‑hupB重组质粒DNA作为模板，在5ul ddH2O中加入1ng pUC19‑hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；(3)培育：将2ul的2.5mM dNTP，2ul的10×BSA，1ul的phi29DNA聚合酶buffer，以及0.2ul的TempliPhi

【技术特征摘要】
2017.07.11 CN 201710562313X1.一种提高多引物RCA特异性的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配置浓度为0.1mg/ml的PEG8000溶液，备用；(2)变性：以pUC19-hupB重组质粒DNA作为模板，在5ulddH2O中加入1ngpUC19-hupB重组质粒DNA，混匀后，95℃加热3min，然后冷却至室温或4℃，获得变性样品液；(3)培育：将2ul的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云威，戚智青，刁勇，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建,35