用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法及其中使用的培养基技术

本发明专利技术提供一种使用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法，包括以下步骤：在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法在２５℃～３５℃下培养趋磁细菌，其中培养基中碳氮比为４∶１～１５∶１，ｐＨ值控制在７．０～７．８之间，氧分压控制在０．５％～２１％之间，菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒；然后收集菌体并提取磁颗粒。本发明专利技术还涉及培养趋磁细菌的培养基。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法。这种方法通过在控制的条件下使趋磁细菌快速生长并在细胞内合成磁性颗粒，从而获得细菌磁性颗粒。本专利技术还涉及培养趋磁细菌的培养基。
技术介绍
细菌磁颗粒是由趋磁细菌合成的一种Fe3O4颗粒，在细胞内逐步合成并沿磁力线排列成链状。它们颗粒大小均匀、一般直径为纳米级(40～50nm)，并具有稳定晶型。每个磁颗粒都有脂蛋白膜包被，因此被称为磁小体(magnetosome)。经研究发现，细菌磁颗粒在医学、生物技术等领域具有十分广泛的应用前景，它的应用主要表现在以下几个方面1)作为固定化酶载体和生物传感器的组成部分Matsunaga等(1987)将葡萄糖氧化酶和脲酶分别固定在细菌磁颗粒、人造磁粒和Zn-Fe颗粒上制成磁化酶，发现，同样的酶量在细菌磁颗粒上和人造磁粒的固定量分别是Zn-Fe颗粒固定量的100倍和40倍。连续使用5次后，细菌磁颗粒固定的酶活力变化不大，而人造磁粒和Zn-Fe颗粒固定的酶活则明显降低。说明被细菌磁颗粒所固定的酶具有稳定、高效等特点。另外，有人试验将葡萄糖氧化酶和脲酶固定在这种磁性颗粒上，作为葡萄糖和尿酸生物传感器的组成部分，也在医学诊断上具有重要意义。2)连接抗体用于快速、高灵敏度的免疫检测利用戊二醛处理后的磁小体，每毫克可偶联29微克的抗体。因此有人利用抗SCC(扁皮细胞癌)抗体连接视频监测系统，可检测SCC抗原。当有SCC抗原存在时，由于抗原抗体结合可使磁颗粒聚集在监测系统而反映出来，这种方法的检测限可达到1.5ng/ml的水平。此技术还可以用于荧光免疫测定。如图1所示，用FITC-抗老鼠抗原抗体-磁小体复合物测定老鼠的IgG。Matsunaga T等(1999)利用基因工程技术在Magnetospirllum sp.AMB-1中合成磁小体的关键基因magA和它的启动子之间插入ProteinA基因，得到了在磁小体表面表达有ProteinA蛋白的磁小体，建立了用磁小体-ProteinA复合物快速高灵敏度地测定人IgG的化学发光酶免疫测定方法，用这种方法检测IgG的最低浓度为1ng/ml。3)制备磁性细胞和纯化某些难以纯化的细胞产物利用趋磁细菌和某些有特殊功能的细胞融合，从而使这种具有特殊功能的细胞带有磁性，利用外加磁场的磁导向作用使之定向地行使其功能。例如，当有免疫活性的细胞与磁细菌融合后，具有趋磁性，它可能在外加磁场的作用下定向地攻击肿瘤细胞。Matsunaga T等1987年成功的用聚乙二醇作融合剂，使趋磁细菌与绵羊的红细胞融合，因而使绵羊的红细胞具有趋磁性。Matsunaga T等又于1989年利用人体白细胞的吞噬作用将趋磁细菌导入了粒细胞和单核白细胞，每个粒细胞和单核白细胞可以吞噬20-40个趋磁细菌，利用Sm-Co磁铁收集除去这些具有趋磁性的细胞，就可得到污染率极低的淋巴细胞。依据这种原理，Matsunaga T(1991)利用磁场控制来回收和纯化产生干扰素的细胞也获得成功。4)用于基因转移利用载有DNA和RNA的微发射物进行基因转移的技术近年发展较快。人们发现细菌磁小体比钨、金或人造磁粒可更多地吸附DNA或RNA，同时用粒子枪转移而获得某一基因的细胞可以方便地利用Sm-Co磁铁选择性的分离，从而使细菌磁小体作为一名自然的侯选者应用于这一生物
Matsunaga T等(1995)用细菌磁性颗粒作为DNA的载体进行了海洋蓝细菌的弹道转化，经Southern杂交和CAT测定表明，外源基因已被成功导入受体细胞，并得以表达。此外，细菌磁性颗粒还可用于mRNA的分离。5)作为药物的载体用于肿瘤的靶向定位治疗利用人造磁性颗粒Fe3O4作为载体与药物混合制备的磁性药物制剂，在足够强的体外磁场作用下注入血管，定位于肿瘤靶区，药物以受控的方式从载体中逐步释放，攻击肿瘤细胞，对正常组织影响较小，此技术为肿瘤的靶向定位治疗开辟了一条新的途径。目前国内外分别开展了一些研究。Lubbe(1996)实施了人造磁粒对大鼠的急性毒性试验，认为人造磁性颗粒的加入不会影响磁性药物制剂的急性毒性，器官毒性在临床治疗中也没有增加。德国、英国也开始对磁性微球免疫毫微粒进行了临床试验，得到肯定结果。我国以张阳德教授为首的课题组，利用血清白蛋白和抗肿瘤药物阿霉素与人造磁粉混合后制备成微小颗粒，在小鼠肝癌细胞的靶向定位治疗中取得令人满意的效果。基于以上研究，我们认为，细菌磁小体颗粒均匀，利用其表面的游离基团，更容易连接药物而用于肿瘤的靶向定位治疗。由于趋磁细菌的生长对环境要求比较苛刻，人工培养困难。通常采用液体静置的培养方法，5～7天后，细胞光密度只能达到OD6000.2，无法获得大量细胞和磁性颗粒，限制了应用。为了解决这一问题，德国、日本、美国和我国学者对趋磁细菌的培养和细菌磁性颗粒的生产进行了一些研究，但目前还没有突破性的进展。德国学者D.Schuler(1997)等采用乙酸钠为碳源的培养基，控制空气供给‘进行格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)的液体培养，70小时后细胞密度为OD4001.4(相当于OD600的0.7)，磁颗粒产量为2.6mg/L培养液。日本学者Matsunaga(2001)在以琥珀酸钠为碳源的培养基培养磁螺菌(Magnetospirillum sp.AMB-1)，144小时后磁颗粒的产量仅为7.4mg/L培养液。因此，本领域希望有一种快速培养趋磁细菌并使其高产率地产生磁颗粒的方法。
技术实现思路
为了实现利用趋磁细菌有效生产磁性颗粒的目的，专利技术人进行了深入的研究，明确了碳源、氮源的种类及浓度与磁螺菌生长和磁性颗粒合成的关系，氧分压和pH值对磁螺菌生长和磁性颗粒合成的影响，最终获得了以下新发现1)磁螺菌的生长速度和磁性颗粒的合成与碳源的种类和浓度密切相关。该菌仅能利用少数几种有机酸或有机酸盐为碳源，如苹果酸钠、乙酸钠、乳酸钠等，且浓度不宜过高(0.05％-2.0％)，否则抑制细胞生长和磁颗粒的合成。2)碳氮比与磁颗粒的合成密切相关。过高或过低的碳氮比均会影响磁颗粒的产率。3)在无铵固氮生长的条件下，细胞不合成磁颗粒。4)环境中氧分压是影响磁颗粒合成的关键因素之一。5)pH值小于6.8或高于8.5不利于细胞生长和磁颗粒的合成。专利技术人基于这些新发现完成了本专利技术。本专利技术利用趋磁细菌生产磁颗粒的方法包括以下步骤在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法在25℃～35℃下培养趋磁细菌，其中培养基中碳氮比为4∶1～15∶1，pH值控制在7.0～7.8之间，氧分压控制在0.5％～21％之间，菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒；然后收集菌体并提取磁颗粒。本专利技术还提供了一种新的培养趋磁细菌的培养基。附图说明图1是用磁小体-Protein A复合物测定人IgG的化学发光酶免疫测定方法的原理。图2显示不同种类碳源对磁细菌(格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌)生长的影响。其中单一碳源培养基中的碳源浓度均为15mM的碳原子数；混合碳源培养基中的各碳源浓度分别为7.5mM碳原子数。a，乙酸钠；b，酒石酸钾钠；c，柠檬酸钠钠；d，D，L-苹果酸；e，琥珀酸钠；f，乳酸钠；g，乙酸钠+酒石酸钾钠；h，乙酸钠+柠檬酸钠；I，本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用趋磁细菌生产磁性颗粒的方法，包括以下步骤： 在含有碳源、氮源和铁源的培养基中通过深层培养法在２５℃～３５℃下培养趋磁细菌，其中培养基中碳氮比为４∶１～１５∶１，ｐＨ值控制在７．０～７．８之间，氧分压控制在０．５％～２１％之间，菌体生长完成后通过降低氧分压使细菌产生磁颗粒；然后收集菌体并提取磁颗粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姜伟，付刚，李颖，田杰生，王珍芳，李季伦，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]