抗菌多肽EC1‑17KV及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，是一种对耐药细菌具有较高抑制活性的阳离子多肽，其通过截取母体结构EeCentrocins 1重链的前17个氨基酸，并突变其第8位天冬氨酸为赖氨酸、14位甘氨酸为缬氨酸，采用固相合成法获得。药效学试验证明本发明专利技术的多肽具有抗细菌，尤其是耐药细菌感染的用途。

EC1 antimicrobial peptide 17KV and its use

The invention belongs to the technical field of biochemistry of peptide drugs, in particular relates to a polypeptide, the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 shows, is a kind of cationic peptides with high inhibitory activity against resistant bacteria, the first 17 amino acids from the parent structure EeCentrocins 1 heavy chain, and its mutation eighth aspartic acid, lysine 14 glycine to valine, by solid phase synthesis method. The pharmacodynamic test shows that the polypeptide of the invention has the use of anti bacteria, especially the infection of drug resistant bacteria.

【技术实现步骤摘要】
抗菌多肽EC1-17KV及其用途
本专利技术属于生物化学中的多肽药物
，具体涉及到一种多肽及其用途，即本专利技术的多肽具有抗细菌，尤其是耐药细菌感染的用途。
技术介绍
抗生素一直以来是人类对抗细菌感染的首选药物，但近几十年来临床抗生素的滥用导致全世界范围内耐药性细菌的出现。全球每年约有2000万人死于耐药细菌感染，并且感染与死亡人数还有逐年上升的趋势。阳离子抗菌肽是自然界天然进化而成、具有抗致病微生物感染的生物活性大分子，存在于不同物种的免疫系统内。天然存在的阳离子抗菌肽长度通常在10到80个氨基酸之间。其结构特征为；①携带正电荷，富含碱性氨基酸，如赖氨酸，精氨酸，此特性被认为与抗菌肽结合携带负电荷的细菌膜结构有关。②抗菌肽发挥抗菌活性的二级结构通常为α螺旋。③结构具有两亲性，其二级结构在空间上表现为在α螺旋的轴向两侧，一面为亲水性残基聚集形成的亲水面，另一面为疏水性残基聚集形成的疏水面。亲水面能与细菌生物外膜磷脂双分子层上暴露的极性基团结合，疏水面能与磷脂双分子层疏水性的脂肪酰基链结合，并随着多肽在细菌细胞膜表面的不断聚集，最终在细菌细胞膜上形成孔洞结构，最终导致细菌内容物外泄。由于阳离子抗菌肽对生物被膜具有物理破坏作用，细菌较难通过靶点的突变对抗菌肽产生耐药，因此抗菌肽有望成为临床治疗重症耐药细菌感染的新型抗生素。EeCentrocins1为分离于海胆体腔液的天然结构肽，该结构为异源二聚体，由长30个氨基酸的重链与长13个氨基酸的轻链构成，全长43个氨基酸，据文献《NovelAntimicrobialPeptidesEeCentrocins1,2andEeStrongylocin2fromtheEdibleSeaUrchinEchinusesculentusHave6-Br-TrpPost-TranslationalModifications》报道，其重链对细菌和真菌具有一定的抗菌效果，MIC值在1.5～6.3μM范围内。
技术实现思路
专利技术人依据发现于海胆体腔液的异源二聚体蛋白EeCentrocins1设计了阳离子抗菌肽EC1-17KV，由17个氨基酸组成，氨基酸序列为GWWRRTVKKVRNAVRKV，分子量2139.58。本专利技术多肽简称：EC1-17KV，是一种对耐药细菌具有较高抑制活性的阳离子多肽，其通过截取母体结构EeCentrocins1重链的前17个氨基酸，并突变其第8位天冬氨酸为赖氨酸、14位甘氨酸为缬氨酸，采用固相合成法获得。EC1-17KV的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。全序列为：甘氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-精氨酸-苏氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-缬氨酸-精氨酸–天冬酰胺-丙氨酸-缬氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸。本专利技术多肽EC1-17KV为单链结构，长度仅为母肽的39.5％，因此能大大降低合成成本。体外抗菌活性研究表明，本专利技术多肽EC1-17KV在截取母肽EeCentrocins1重链的前17个氨基酸并进行定点突变的条件下，仍对青霉素耐药的革兰氏阳性/阴性菌表现出良好的抗菌效果(MIC≤16μg/ml)，其抗菌活性与母肽相当。同时，杀菌曲线结果表明，多肽EC1-17KV对临床耐药细菌表现出良好的杀菌活性，能在8h内杀灭所有受试菌株。所述的临床耐药细菌包括革兰氏阴性菌(大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(粪肠球菌和化脓性链球菌)。体外毒性研究表明，本专利技术多肽EC1-17KV在1024μg/ml浓度下对绵羊红细胞的溶血率仅为0.5％；对小鼠原代脾细胞的增殖抑制率为32.7％，而在512μg/ml浓度下，抑制率不到15％。说明本专利技术多肽对哺乳动物细胞的毒性极小。小鼠腹腔感染细菌构建菌血症模型研究多肽EC1-17KV的体内抗菌活性，结果表明，多肽EC1-17KV能显著提升耐药铜绿假单胞菌腹腔感染小鼠的生存率，降低感染小鼠血液和肺组织的细菌负载量，且对感染小鼠炎症反应和肺组织损伤具有良好的缓解作用。下面是本专利技术多肽的部分药效学试验及结果：一、本专利技术多肽EC1-17KV的体外抗菌活性测定(1)多肽EC1-17KV的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)①菌液的制备将试验所需菌株从-20℃保藏的甘油管中接种至营养琼脂斜面，置于37℃培养箱中培养18h后，用接种针挑取少许接种至2ml营养肉汤培养基中，37℃恒温培养8h，用MH培养基倍比稀释，制备细菌浓度为105CFU/ml左右的菌悬液。②药物的配制称取适量的EC1-17KV溶于无菌生理盐水，将其配成浓度为1024μg/ml的多肽母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后分装，保存于-20℃备用。③MIC和MBC的测定采用微量培养基稀释法测定多肽EC1-17KV对细菌的MIC值。取100μl菌悬液(105CFU/ml)，接种96孔板。等体积加入经MH倍比稀释的EC1-17KV母液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。同时，设100μl菌液加入等体积的MH培养基作为只含菌液的阳性对照组，200μl的MH培养基作为不含菌液和药物的空白对照组。将96孔板置于37℃恒温培养18h。酶标仪测定各孔在595nm处的吸光度值并记录，药物能够完全抑制菌液生长的最低浓度被定义为最低抑菌浓度，即MIC。取上述步骤中96孔板，吸取未见浑浊的培养物100μl，加入900μl无菌培养基稀释后，转移至无菌平皿中，加入恒温55℃的营养琼脂培养基约10ml，充分晃匀，待凝固，置于培养箱中过夜培养。18-24h后，观察并记录平板上的菌落数，菌落数小于5个的最低药物浓度，即为MBC。结果见表1：表1多肽EC1-17KV、粘菌素及青霉素V钾对耐药细菌的MIC和MBC值a临床耐药菌株由表1看出，本试验所选耐药菌株对青霉素V钾均表现出耐药性(MIC>256μg/ml)，而EC1-17KV对耐药菌株表现出良好的抗菌效果(MIC≤16μg/ml)。同时，青霉素V钾在试验浓度内未能杀死耐药细菌，而多肽EC1-17KV对所选试验菌株的MBC≤32μg/ml。(2)多肽EC1-17KV的杀菌曲线用营养肉汤培养基将上述制备的细菌悬液重悬，调整细菌浓度为1×105CFU/ml左右，加入多肽EC1-17KV(终浓度为4×MIC)，置于37℃恒温培养，在0、1、2、4、8h时，吸取混合培养物100μl进行系列稀释，将稀释液转移至无菌平板中，倒入营养琼脂培养基混匀，每个稀释度均设置三个平行对照。置于37℃恒温培养18h后进行菌落计数，计算平均值。以细菌数量的对数值为纵坐标，药物作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见图1-4：由图1-4可以看出，EC1-17KV对试验菌株具有良好的杀菌作用，杀菌效果迅速，8h内使大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和化脓性链球菌下降约5个lgCFU，细菌完全被杀死。由此可见，EC1-17KV对临床青霉素耐药的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌和化脓性链球菌具有良好的杀伤作用。二、本专利技术多肽EC1-17KV对真核细胞的毒性(1)多肽对绵羊红细胞溶血活性的影响将新鲜的脱纤维绵羊血离心(3000rpm，10min)，弃上清，下层红细胞用PBS洗涤3次，吸取300μl绵羊红细胞重悬于10ml的PBS中，制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌多肽，其特征是：氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌多肽，其特征是：氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种药物组合物，其中含有权利要求1的抗菌多肽及药学上可接受的载体。3.权利要求1的抗菌多肽用于制备治疗耐药细菌感染疾病的药物的用途。4.权利要求3的用途，其中耐药细菌是铜绿假单...

【专利技术属性】
技术研发人员：马菱蔓，周丽，孙鹏博，史翔宇，林健，安胜祥，窦洁，周长林，
申请(专利权)人：中国药科大学，江苏美通制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32