虎斑乌贼神经肽FMRFamide及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其基因cDNA序列全长约1856 bp，开放阅读框996 bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334 bp，3’非翻译区526 bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。神经肽FMRFamide作用机理的探测方法包括神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析、神经肽FMRFamide组织特异性表达分析和神经肽FMRFamide脑组织表达定位分析。其验证了FMRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。

Neuropeptide FMRFamide of squid and its use

The invention discloses a sepia pharaonis neuropeptide FMRFamide, the full-length cDNA of about 1856 BP, open reading frame 996 BP, encoding 331 amino acids, 5 'untranslated region of 334 BP, 3' untranslated region of 526 BP precursor protein predicted relative molecular mass of 38.7kDa and isoelectric point 9.09. The detection mechanisms of neuropeptide FMRFamide include neuropeptide FMRFamide gene cloning and sequence analysis, neuropeptide FMRFamide tissue specific expression analysis, and neuropeptide FMRFamide brain tissue expression and location analysis. It validates the possibility of artificial reproduction of FMRFamide in cephalopod species to optimize the use of the scale artificial reproduction of the squid in China.

【技术实现步骤摘要】
虎斑乌贼神经肽FMRFamide及其用途
本专利技术涉及神经肽
，本专利技术具体是一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide及其用途。
技术介绍
头足类（Cephalopoda）属于软体动物门头足纲，广泛分布在各个海域，在生物的系统演化的过程中占有重要地位。其肉质鲜美可口，肌肉含有相当丰富的营养物质，尤其是蛋白含量非常高。除了可以被食用外，更重要的是还具有重要的研究价值，其墨囊可以促进血液凝固且还含有抗菌成分，海螵蛸可以用作医学药材，耳石可以用来分析物种存在的年轮和海洋环境随时间和空间的变化特点。另外头足类还是海洋生态系统中重要的生物因子，在生态系统食物链中作为捕食者和被捕食者，对维持海洋生态系统的稳定具有重要的作用。神经肽是广泛存在于动物体内的小分子多肽，由神经组织分泌，具有调节神经活动、机体生长、发育等各种生理功能，神经肽同时还能充当生长因子、营养因子等信息分子。神经肽是一类比较古老的信息分子，真菌乃至细菌体内都存在神经肽。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide，运用分子生物学技术手段探测神经肽FMRFamide对虎斑乌贼生殖行为影响的机制，以及对整个乌贼生殖调控机理。验证FMRFamide在头足类物种中进行人工生殖调控的可能性。本专利技术的目的之二在于提供一种虎斑乌贼神经肽FMRFamide的用途，用于优化我国虎斑乌贼的规模化人工繁殖的用途。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其特征在于cDNA序列全长约1856bp，开放阅读框996bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。神经肽FMRFamide作用机理的探测方法包括神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析、神经肽FMRFamide组织特异性表达分析和神经肽FMRFamide脑组织表达定位分析。神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析步骤包括：提取成熟虎斑乌贼脑组织总RNA，使用反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成，将合成的cDNA置于-30~-15℃保存备用；根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种FMRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物：FMRF-F：GCTGAAGATGAACTGGAAGAG；FMRF-R：CAAAWAACTGAATGWCGCAGG；FMRF-5'outer：GATGTCTCTAGCTTGCTTCC；FMRF-5'inner：GATGGAGCCGCACACACAGAC；FMRF-3'outer：GAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAA；FMRF-3'inner：GGCGGTGAAGACGATGACGTGAACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；5’RACEAdapter：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer：GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT。神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析步骤包括：以虎斑乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物FMRFamide-F和FMRFamide-R进行FMRFamide基因核心片段的PCR扩增；PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min；电泳检查产物，用QIAGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pMD18-T载体相连接，转化至E.coli5α感受态细胞中，进行PCR检测后，将阳性克隆产物进行测序。神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析步骤包括：利用目的基因已知序列设计分别用于FMRFamide基因3’端RACE和5’端RACE扩增的特异性引物3’FMRFamide-outter、3’-FMRFamide-inner和5’-FMRFamide-outter、5’-FMRFamide-inner。其中，FMRFamide基因cDNA全长为：AGAACAAGGAGAAGATCCCACGTTCCAATCAACGCAAAGGCGAAGAGCACACAGCTAAAAGCAACAACAACAAACAATCATTCCCCCATAAATAAAAAAAGGCTGATTCATTGGACTGAAGAGAAAACAACGCACGTTGGTGCCTTGTTGTTTTCCTCTTGCTCGTAGTTCTCAGCGTGTACCTTCGTATCTTTTTGTCTGTGTGTGCGGCTCCATCACCGTACCCCGTCTTTGCTAGTGTCCCCTACCTCTGTAGTCGGACCTAAGTCATCTTGTTCCTGTAGGAGCGCCCATTTACCCTTGGCAGATTTAGAAAGAATAACGGGACCCCGTGATGCGTTGTTGGAGTCCCTGTAGCCTACTTGTCGTCATCGCCATCTACTGTCTCTCTTCGCATACGTCTGAAGCCTTTGATTTGGCCCAGGCATGCGTCGAGTCTCAGCGAATGAGTCTTCTTCCGATTTGTGATACAATCTTTGCTGTACAGCAAGAAGGAGCTCAGCAAAGTGCGGATGATGGACTGAGAAGCAAACGTTTCATACGCTTTGGAAGAGCCCTGTCAGGAGATGCTTTCTTGCGTTTTGGGAAAAATGTACCAGACCTTCCTTTCGAAGATAAAAGATTCCTTCGATTTGGACGAGCAGCTCCTCAGTTGGATGACTTGCTCAAACAAGCCCTGCAGAGAGTTGAAAGCTTGCAAAAGGCCGACGACACCAGTGTTCGACGAAAGCGATCCACAGACGCCGCTCCCCCAAAGCAAACAGATAGTGCTGAACAGAAAAACGATAGCGCAAAAATCACAAAAAGATACGTCGATGACGTCGAAGATTCTGATGTGAAGAGATTCATGCGCTTCGGTAAGAGATTTATGCGTTTTGGCCGTAACCCGAGCGATGTTGGCAACAAACTGAACGAAAAGCGATTCATGAGATTTGGACGTGATCCCGAAAAAAGGTTCATGCGTTTTGGCAAATCAGATGACAAGAGGTTCATGAGATTCGGTCGAAACCCCGGCGATGCTGAAGATGAACTGGAAGAGGATAAACGTTTTATGAGATTCGGACGTGGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其特征在于cDNA序列全长约1856 bp，开放阅读框996 bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334 bp，3’非翻译区526 bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。

【技术特征摘要】
1.虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其特征在于cDNA序列全长约1856bp，开放阅读框996bp，编码331个氨基酸，5’非翻译区334bp，3’非翻译区526bp，前体蛋白预测相对分子质量38.7kDa，等电点9.09。2.根据权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其特征在于：所述的神经肽FMRFamide作用机理的探测方法包括神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析、神经肽FMRFamide组织特异性表达分析和神经肽FMRFamide脑组织表达定位分析。3.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其特征在于：所述的神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析步骤包括：提取成熟虎斑乌贼脑组织总RNA，使用反转录试剂盒，利用虎斑乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成，将合成的cDNA置于-30~-15℃保存备用；根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种FMRFamide基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆虎斑乌贼FMRFamide基因核心序列片段的简并引物：FMRF-F：GCTGAAGATGAACTGGAAGAG；FMRF-R：CAAAWAACTGAATGWCGCAGG；FMRF-5'outer：GATGTCTCTAGCTTGCTTCC；FMRF-5'inner：GATGGAGCCGCACACACAGAC；FMRF-3'outer：GAAACCCTGAGGACCAAGAAGCTGACAA；FMRF-3'inner：GGCGGTGAAGACGATGACGTGAACT；M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT；M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC；5’RACEAdapter：GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG；5’RACEOuterPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA；5’RACEInnerPrimer：ACUACUACUAGGGGCGTCGA；3’RACEAdapter：GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT；3’RACEOuterPrimer：GCGGATCCGAATTAATACGACT；3’RACEInnerPrimer：GCGAGCACAGAATTAATACGACT。4.根据权利要求2所述的虎斑乌贼神经肽FMRFamide，其特征在于：所述的神经肽FMRFamide基因克隆和序列分析步骤包括：以虎斑乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物FMRFamide-F和FMRFamide-R进行FMRFamide基因核心片段的PCR扩增；PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃8min；电泳检查产物，用QIAGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，将其与pMD18-T载体相连接，转化至E...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟长凤，朱阳，孙连莲，曹子豪，吕振明，黄伟，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33