一种仿生止血生物胶制造技术

本发明专利技术提供一种仿生止血生物胶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：本发明专利技术还提供一种止血材料，所述的止血材料包含有氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白和Dopa修饰的海藻酸钠。本发明专利技术提供一种具有止血性能制品，是使用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的制备的多肽和褐藻酸钠衍生物制备成的；使用结果表明氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白的加入改善了材料的超微结构，体外实验证明复合材料具有良好的止血效果。

Bionic hemostat

The invention provides a biomimetic hemostatic gel, the amino acid sequence of SEQ ID NO:1: the invention also provides a hemostatic material, the hemostatic material contains the amino acid sequence of Dopa protein and SEQ ID NO:1 modified sodium alginate. The invention provides a product having hemostatic performance, is prepared by using the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 preparation of peptides and sodium alginate derivatives; use results show that the amino acid sequence of SEQ ID NO:1 added protein improved the ultrastructure of materials, in vitro experiment shows that composite materials have good hemostatic effect.

【技术实现步骤摘要】
一种仿生止血生物胶
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种仿生止血生物胶。
技术介绍
随着人类活动范围和生活方式的多样化,意外事件越来越多,其中因为过量失血导致的死亡,已经越来越引起人们的重视。轻微的创伤不足以致命,若在短时间内失血量达全身血液的30％或更多,就会危及生命。能否及时挽救伤者的生命,具有止血效果快、生物相容性优良的高效止血材料是必不可少的。现有的止血纱布,止血绷带等止血材料在使用中都有一定的局限性；例如易与伤口粘连不容易换药,对感染和化脓伤口也无能为力。还有一些止血材料主要包括胶原蛋白类、氧化再生纤维素类、藻酸盐类等,但大部分起效慢,不适应紧急出血的突发状况。为减少因失血而造成的不必要的死亡,各国医学界对止血材料止血性能的要求更高了。因此,开发出一种能战时急救与平时创伤救治相结合,具有止血效果快、生物相容性优良,并能在体内降解的生物医用新材料,是许多研究者追求的目标。作为止血敷料或止血剂的材料要具备良好的止血性能,优良的生物相容性,无毒副作用,无刺激性,易于加工成型等。因此,从现有的条件出发,寻找自然界中优良的生物材料并加以加工、改进就成为一种理想的选择。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种仿生止血生物胶，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种具有粘附功能的蛋白(命名为EGF-likesbp9，EGFLsbp9)，其氨基酸序列为SEQIDNO:1：APCGGSCKANEHCDMHSQECVCNTGYKLYKKACVLPCGGPCKQYERCDEGSNKCVCMTGYSLFKGSCVVPCGGPCGPNAYCDKNKNQCNCNKGYFTYHGVCALPCGGPCKQNANCDKNSNQCVCNKGYKEIGGVCAV；本专利技术所提供的EGFLsbp9蛋白可用于制备止血材料；本专利技术的具体实施例中所提供的一种止血材料，所述的止血材料包含有EGFLsbp9蛋白和Dopa修饰的海藻酸盐；更进一步的，所提供的止血材料中还包含有用于止血的多糖材料；所述的多糖材料，其一种为壳聚糖或其衍生物。作为优选，所述的海藻酸盐为海藻酸钠和/或海藻酸钾；所述的Dopa修饰的海藻酸钠，其制备方法如下：将海藻酸钠溶于MES缓冲溶液中，再加入NHS和EDC进行搅拌反应；再加入盐酸多巴胺室温搅拌混合反应，反应结束后进行透析，透析得到的样品冷冻干燥后获得Dopa-SA；其中EDC的摩尔比与海藻酸钠摩尔比为1.5-2.5:1，NHS的摩尔比与海藻酸钠摩尔比为1:1，多巴胺与海藻酸钠的摩尔比率为1.5-2.5:1。本专利技术提供一种具有止血性能制品，是使用氨基酸序列为SEQIDNO:1的制备的多肽和褐藻酸钠衍生物制备成的；使用结果表明氨基酸序列为SEQIDNO:1的蛋白的加入改善了材料的超微结构，体外实验证明复合材料具有良好的止血效果。附图说明图1.重组EGFLsbp9纯化后蛋白电泳图；图2：水不溶性生物胶图；图3：生物胶的超微结构图；图4：体外(肝脏)止血实验图；图5：静脉止血实验图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1蛋白EGFLsbp9重复序列的体外表达方法。本专利技术通过分析扇贝足转录组，发现了本专利技术具有细胞粘附功能的蛋白Sbp9，发现其中一段具有EGF重复序列的蛋白，命名EGFLsbp9，其氨基酸序列如下：APCGGSCKANEHCDMHSQECVCNTGYKLYKKACVLPCGGPCKQYERCDEGSNKCVCMTGYSLFKGSCVVPCGGPCGPNAYCDKNKNQCNCNKGYFTYHGVCALPCGGPCKQNANCDKNSNQCVCNKGYKEIGGVCAV；1.EGFLsbp9的表达利用限制性内切酶将基因片段连接至pET28a，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组表达系统。使用LB培养基将其培养至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.2mM，诱导过夜。离心收集菌体，-80℃保存。2.EGFLsbp9的分离纯化菌体使用PBS重悬，超声破碎。16,000g离心10min后弃上清，沉淀分别使用PBS，1M尿素/1％甘油(v/v)/1％TritonX-100(v/v)洗涤，16,000g离心10min后弃上清。沉淀使用20mMTris-HClpH8.5/8M尿素/10mMDTT/1mMEDTA溶解，最终透析至20mMTris-HClpH8.51mMDTT中。经过纯化后的重组EGFLsbp9蛋白如图1所示。实施例2海藻酸钠接枝Dopa(Dopa-SA)的化学合成合成了Dopa修饰的海藻酸钠衍生物，命名为Dopa-SA。称取0.2g海藻酸钠溶于15mLpH6.3的0.1MMES缓冲溶液中，室温搅拌直至溶解，大约需要1h，终浓度为1％(w/v)。至海藻酸钠完全溶解后加入0.1162gNHS和0.2903gEDC，保持EDC的摩尔比与海藻酸钠摩尔比为1.5-2.5:1，保持NHS的摩尔比与海藻酸钠摩尔比为1.5-2.5:1，室温充分搅拌1h。加入5mlpH6的MES缓冲溶液，加入0.2872g盐酸多巴胺,保持多巴胺与海藻酸钠的摩尔比率为1.5:1，室温搅拌混合。待盐酸多巴胺在海藻酸钠溶液中溶解后，测得溶液pH为6.0室温缓慢搅拌24h(磁力搅拌器，120r/min)。搅拌结束后进行透析，透析到酸性蒸馏水中；透析后得到的样品冷冻干燥后获得Dopa-SA。实施例3：凝血胶的制备取修饰好的Dopa-SA，在PBS溶液中配制成浓度为2％(wt)的溶液，4℃条件下搅拌溶解24h。之后6000g离心10min,去除气泡。取200μl样品滴在盖玻片上，按比例(摩尔比5-10:1)加入制备的EGFLsbp9重组蛋白制备凝胶。结果发现，在加入EGFLsbp9后5min，获得了具有一定粘附性能的水不溶性生物胶(图2)。1、生物胶的超微结构观察取1mlDopA-SA放在载玻片上，按照比例(摩尔比5-10:1)加入EGFLsbp9，搅拌混匀。成胶后，将水凝胶转入24孔板中后放入-80℃条件下24h，然后将冷冻样品进行真空冷冻干燥。冷冻干燥后的水凝胶呈白色蓬松状，将冻干后样品用刀片快速剪切，切下薄片后喷金，在S-3400型电子显微镜5kv下观察进行观察。结果如图3所示：从孔径大小可以看出加入EGFLsbp9以后材料交联的聚合度增加，孔径变小，提示其可能具有更好的机械性能及生物学功能。2、体外(肝脏)止血实验首先将Dopa-SA材料溶解在PBS溶液中，浓度为2％。分装在1mL注射器中，密封保存。将EGFLsbp9蛋白溶解后备用，之后按照摩尔比5-10:1的比例制备止血胶。将SD大鼠肝脏暴露，制造出血点后将配制好的凝胶涂在出血的地方。通过比较出血的面积来评价胶的止血性能。如图4所示，结果发现EGFLsbp9的加入可以改善Dopa-SA对肝脏的止血性能；3、静脉止血实验按照实施例3的方法制备生物胶，备用。将SD大鼠肌肉暴露出来，找出大鼠腿部静脉，用注射器针头扎破静脉，制造出血点。空白对照组扎破涂上200μlDopa-SA溶液。实验组在扎破血管时，快速敷上加入EGFLsbp9成胶后制备的凝胶。观察出血状况，并拍照。如图4所示，EGFLsbp9的加入可以改善Dopa-SA对静脉的止血性能。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有粘附功能的蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种具有粘附功能的蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.权利要求1所述的蛋白在制备止血材料中的应用。3.一种止血材料，所述的止血材料包含有权利要求1所述的蛋白和Dopa修饰的海藻酸盐。4.如权利要求3所述的止血材料，其特征在于，所述的Dopa修饰的海藻酸盐与蛋白的摩尔比为5-10:1。5.如权利要求4所述的止血材料，其特征在于，所述的海藻酸盐为海藻酸钠和/或海藻酸钾。6.如权利要求5所述的止血材料，其特征在于，所述的Dopa修饰的海藻酸钠，其制备方法如下：将海藻酸钠溶于ME...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟治，律倩倩，汪丹丹，徐平平，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东,37