一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX‑58的高效表达系统与分离纯化方法。本发明专利技术通过基因工程技术，采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统，经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到敬钊毒素‑58(JZTX‑58)蛋白质，解决了直接从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化而很难得到足量毒素来进行功能研究的难题，为进一步研究JZTX‑58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。

A method for purifying high expression of toxin protein separation and Zhao Jing

The invention belongs to the field of biotechnology, discloses a Jing Da Mao spider venom active peptides in JZTX 58 efficient expression system and purification method. The present invention by gene engineering technology, the eukaryotic expression plasmid system composed of pVT102U/ alpha and S78 of Saccharomyces cerevisiae strains, identified by mass spectrometry after separation and purification, the successful expression of Jing Zhao get 58 toxin (JZTX 58) protein, solved directly from chilobrachys Jingzhao venom purification and it is difficult to obtain enough to study the problem of toxin function, laid an important foundation for the further study of JZTX 58 anti Plasmodium activity.

【技术实现步骤摘要】
一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法
本专利技术属于生物
，涉及敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。
技术介绍
疟疾是原生动物寄生虫疟原虫(paslmodium)引起的传染性寄生虫疾病，这种疾病几乎流行于所有的热带和亚热带国家。现在，每年有500百万人感染此病，遍及非洲、南亚次大陆、东南亚和南美洲；每年有250万人死于此病，其中约有1百万人是5岁以下的儿童。可悲的是，目前疟原虫对治疗疟疾所用的药物普遍产生了抗药性(耐药性)。抗疟原虫活性的新型药物研究成为防治疟疾的新热点。蜘蛛利用毒液麻痹和杀死猎物，并防御其它肉食性动物。研究发现，蜘蛛毒液中含有各种各样的生物活性分子，随着生物科学技术的发展与突破，部分多肽毒素分子己被开发成为生物学、医学、药物学等众多研究领域的先导分子。敬钊缨毛蛛(Chilobrachysjingzhao)是一类地下穴居的原始蜘蛛,隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属，是近年在我国发现的又一蜘蛛新种，产于广西及海南等地。其形态与海南捕鸟蛛、虎纹捕鸟蛛十分相似，个体较海南捕鸟蛛大，体呈黄褐色，腹部背面无虎纹斑。毒性及凶猛程度更大，其毒液对小鼠具有致命性(IC50为0.4mg/kg)。敬钊缨毛蛛粗毒中含有多种生物活性成分。采用阳离子交换与反相高效液相色谱技术，己从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化得到敬钊毒素-58(JZTX-58)。对JZTX-58的氨基酸序列进行BLAST分析,发现PsalmopeotoxinI和II与JZTX-58有很高的同源性，而PsalmopeotoxinI和II具有抗疟原虫活性，因此推测JZTX-58具有抗疟原虫活性，这对研究抑制疟原虫传播和有效治疗疟疾具有深远的意义。敬钊缨毛蛛粗毒中含有的多肽毒素种类很多，而其中含量较丰富的毒素分子只有极少数几种，对于大部分含量不够丰富的毒素分子(如JZTX-58)若用直接从粗毒中分离纯化的手段则很难得到足量的毒素来进行功能研究。因此，通过基因工程技术，构建高效表达系统，来表达敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白，为进一步研究JZTX-58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法。为实现本专利技术的目的，采用如下技术方案：一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，包含以下步骤：(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。优选的，所述步骤(1)的引物序列为：上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，包含以下步骤：(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养；(5)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白分离与纯化：收集酵母表达系统培养液，采用阳离子交换柱层析的分步洗脱方法进行蛋白分离，采用反相高效液相色谱进行纯化。优选的，步骤(1)所述的引物序列为：上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA，下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。优选的，步骤(5)所述的阳离子交换柱层析的分步洗脱方法过程为：将表达上清液注射入系统中，在上样完毕接着用0.1MNaAc、pH4.2的平衡液冲柱子，使波长280nm处检测值达到基线，光吸收值不再跳动，之后依次用含有0.1M、0.2M和0.3MNaCl的0.1MNaAc、pH4.2的缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。优选的，步骤(5)所述的采用反相高效液相色谱进行纯化过程为：检测波长为280nm，反相柱温度为40℃，先用体积分数0.1％TFA的双蒸水脱盐10min，将所收集各洗脱峰的溶液上Waters的C18反相柱进行脱盐，按照制定的洗脱梯度进行洗脱，收集洗脱峰时标记好各峰的出峰时间。本专利技术提供了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。通过基因工程技术，采用表达质粒pVT102U/α和酿酒酵母S78菌株构成真核表达系统，经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到了敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白质，解决了直接从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化而很难得到足量的毒素来进行功能研究的难题，为进一步研究JZTX-58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。附图说明图1是质粒pVT120U/α结构示意图。图2是JZTX-58蛋白反向高效液相色谱分离图谱。图3是保留时间为22min的目的肽峰质谱分析图。具体实施方式本专利技术实施例公开了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX-58的高表达系统构建与分离纯化方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关技术参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。实施例1敬钊毒素-58(JZTX-58)真核表达系统的构建(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA；下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA；通过PCR扩增敬钊毒素-58(JZTX-58)基因，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58。(2)酵母感受态细胞制备本专利技术所用质粒pVT102U/α(图l)与酿酒酵母菌S-78(SaccharomycescerevisiaestrainS-78，Leu2，Ura3，Rep4)均为湖南师范大学蛋白质组学与发育生物学省部共建国家重点实验室培育基地保存。按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，已克隆到表达载体pVT102U/α。pVT102U/α包含一个大肠杆菌复制起点，一个酵母2μ复制起点，大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因，酵母中URA3基因，ADH1启动子以及酵母α因子前体的信号肽。将酵母菌S-78接种到YPD平板，30℃培养2-3天；挑取直径为2-3mm的单克隆于3mLYPD培养液中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于包含以下步骤：(1)表达载体构建：按照JZTX‑58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α‑JZTX‑58；(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/‑JZTX‑58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；(4)敬钊毒素‑58(JZTX‑58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。

【技术特征摘要】
1.一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于包含以下步骤：(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；(4)敬钊毒素-58(JZTX-58)蛋白表达：选用YPD培养液对上述酵母表达系统进行扩大培养。2.根据权利要求1所述的一种敬钊毒素蛋白的高效表达方法，其特征在于所述步骤(1)的引物序列为：上游引物：CGAATCGGGAATTCCATATGTACTATTTCTCTTA下游引物：CATCGGACGCGTCGACTTAGGCAGCAACTTCATA。3.一种敬钊毒素蛋白的分离纯化方法，其特征在于包含以下步骤：(1)表达载体构建：按照JZTX-58成熟肽cDNA序列设计引物，克隆到表达载体pVT102U/α，构建表达载体pVT102U/α-JZTX-58；(2)酵母感受态细胞制备：采用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞；(3)质粒转入酵母感受态细胞：采用热转化法将质粒pVT102U/-JZTX-58转入制备好的酵母感受态细胞，形成敬钊毒素蛋白表达系统；(4)敬钊毒素-5...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍林巨，罗玉娇，张常昕，夏艳冬，司品法，张允雷，刘一佑，金伟，雷兰婷，
申请(专利权)人：湖南甲骨文生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43