一种天蚕素B抗菌肽突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种天蚕素B抗菌肽突变体及其制备方法和用途。本发明专利技术的抗菌肽对大肠杆菌、绿脓假单胞菌和枯草芽孢杆菌等具有抑制作用，还能抑制肺癌细胞的增殖，可用于制备抗菌和肺癌药物。本发明专利技术的抗菌肽还能有效抑制由脂多糖引起的机体促炎症细胞因子水平升高，可用于开发抗炎症药物。

A kind of antibacterial peptide cecropin B mutant

The invention discloses an antibacterial peptide cecropin B mutant and its preparation method and application thereof. The antibacterial peptide of the invention has inhibitory effects on Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis, and can inhibit the proliferation of lung cancer cells, and can be used for preparing antibacterial and lung cancer drugs. The antibacterial peptide of the invention can also effectively inhibit the increase of the level of inflammatory cytokine induced by lipopolysaccharide, and can be used to develop anti - inflammatory drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种天蚕素B抗菌肽突变体
本专利技术涉及抗菌肽，具体涉及一种含有32个氨基酸的来源于中国橡木蚕蛾抗菌肽天蚕素B的突变体。本专利技术同时还涉及该抗菌肽的基因工程制备方法及其在制备抗菌药物、抗癌药物和抗炎症药物方面的应用，属于生物化学

技术介绍
近年来，滥用抗生素产生的耐药性问题日益严重，对人类疾病造成了巨大威胁，作为一个日益突出的国际问题，将影响到我们的现在和未来。为了应对耐药菌感染，人们一方面对传统抗生素进行结构改造以降低细菌的耐药性，另一方面也在不断研究和开发新型抗菌药物。近年来出现的抗菌肽(Antibacterialpeptide，ABP)就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。抗菌肽是一类由基因编码的两亲性小分子多肽，一般由12～100个氨基酸残基组成，是机体先天性免疫系统中一种古老而又重要的组成成分。抗菌肽的正电性和两亲性能够介导其与细菌细胞膜表面负电性物质发生相互作用，并产生跨膜孔道或破坏细菌胞膜脂质系统，从而导致细胞受损或死亡。此外，抗菌肽也可穿过细菌胞膜，通过抑制某种蛋白质、核酸的合成，使细胞死亡。对革兰氏阴性细菌而言，脂多糖是其细胞壁的主要组成部分，它能提供细菌以结构的完整性，并保护细菌膜免受某些化学物质的攻击。脂多糖被称之为内毒素，是革兰氏阴性菌主要致病成分，可引起强烈免疫反应，导致几乎所有的真核细胞发生形态、代谢和基因表达变化，刺激宿主细胞因子失控性表达，发生严重感染(Schulte等,2013,MediatorsInflamm.2013:165974)。已报道有多种抗菌肽可中和脂多糖的细胞毒性(Ding等,2003,Biochemistry.42(42):12251-12559)，抑制单核巨噬细胞活化、降低促炎细胞因子生成，并充当单核细胞和T淋巴细胞趋化因子，使其快速聚集于炎症反应部位，从而尽快消除炎症，抗菌肽的这一显著特性使其成为新一代抗感染制剂的新星。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗菌肽，其来源于一种名为Antheraeapernyi的中国橡木蚕蛾所分泌的抗菌肽天蚕素B，该天蚕素B含有35个氨基酸。专利技术人将其铰链区的3个氨基酸AGP去除，从而得到了本专利技术的抗菌肽(KL32)，其氨基酸序列如下所示：KWKIFKKIEKVGRNIRNGIIKAVAVLGEAKAL(SEQIDNO.1)。本专利技术还提供一种核酸，其编码本专利技术的天蚕素B抗菌肽突变体。本专利技术还提供一种载体，其包含本专利技术的核酸。在优选的实施方案中，所述载体为表达载体，更优选为原核表达载体。本专利技术还提供一种宿主细胞，其包含本专利技术的载体或本专利技术的核酸。在优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术还提供一种制备KL32的方法，所述方法包括将所述KL32的编码基因与所述表达载体可操作性的连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化到宿主细胞中；培养重组宿主细胞，诱导重组蛋白表达，收集并纯化表达的目的蛋白。在优选的实施方案中，所述方法包括将Sumo标签基因(Sumo标签基因N端有6个组氨酸标签)和编码所述KL32的核酸序列依次连接在一起。将该基因与表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主表达细胞，培养重组宿主细胞，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，利用Sumo酶切割Sumo标签，并进行反向高效液相色谱从而纯化KL32。在优选的实施方案中，对于本专利技术所述的突变体，诱导表达条件为：37℃培养细胞到OD600达到0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导表达4h。在一个实施方案中，本专利技术的纯化方法包括将收集到的菌体用裂解缓冲液(50mMNaH2PO4，300mMNaCl，pH8.0)重悬，进行细胞超声破碎，离心，收集上清液，将上清液与Ni纯化填料混合后4℃孵育2h，将混合物转移到层析柱中，进行蛋白纯化，将纯化得到的Sumo-KL32用Sumo酶酶切，酶切条件包括：温度为4℃，缓冲液为50mMTris，100mMNaCl，pH8.0，切割6h，利用反向高效液相色谱得到KL32。另一方面，本专利技术提供所述抗菌肽KL32在制备药物中的用途，所述药物可用于治疗细菌性疾病、肺癌和由脂多糖引起的机体炎症病症。更具体地，本专利技术提供以下各项：1.一种来源于中国橡木蚕蛾的天蚕素B抗菌肽突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种核酸，所述核酸编码1所述的抗菌肽突变体。3.一种载体，所述载体包含2所述的核酸。4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含1所述的核酸或3所述的载体。5.1所述的抗菌肽突变体、2所述的核酸、3所述的载体或4所述的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗细菌感染疾病。6.5所述的用途，其中所述细菌包括大肠杆菌、绿脓假单胞菌和枯草芽孢杆菌。7.1所述的抗菌肽突变体、2所述的核酸、3所述的载体或4所述的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗肺癌。8.1所述的抗菌肽突变体、2所述的核酸、3所述的载体或4所述的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗由脂多糖引起的促炎症因子或一氧化氮上调所介导的炎症反应。9.1所述的抗菌肽突变体、2所述的核酸、3所述的载体或4所述的宿主细胞用于预防或治疗细菌感染疾病的用途。10.1所述的抗菌肽突变体、2所述的核酸、3所述的载体或4所述的宿主细胞用于预防或治疗肺癌的用途。11.1所述的抗菌肽突变体、2所述的核酸、3所述的载体或4所述的宿主细胞用于预防或治疗由脂多糖引起的促炎症因子或一氧化氮上调所介导的炎症反应的用途。12.一种用于预防或治疗细菌感染疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的1所述的抗菌肽突变体。13.一种用于预防或治疗肺癌的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的1所述的抗菌肽突变体。14.一种用于预防或治疗由脂多糖引起的促炎症因子或一氧化氮上调所介导的炎症反应的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的1所述的抗菌肽突变体。附图说明图1.Sumo-KL32表达载体示意图。图2.KL32蛋白经反向高效液相色谱纯化后的SDS-PAGE图。图3.KL32蛋白对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度。图4.盐离子浓度对KL32蛋白抑制大肠杆菌的最小抑菌浓度的影响。图5.KL32蛋白对人肺癌细胞的毒性实验结果。图6.KL32蛋白对脂多糖引起的巨噬细胞产生一氧化氮的影响。图7.KL32蛋白对脂多糖引起的巨噬细胞表达炎症因子的影响。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅具有范例性，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1.重组天蚕素B抗菌肽突变体KL32表达载体构建首先根据大肠杆菌偏爱密码子，对天蚕素B抗菌肽突变体基因的核苷酸序列进行优化，之后通过引物拼接方法获得目的基因，核苷酸序列优化和引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成(以来源于中国橡木蚕蛾的抗菌肽—天蚕素B作为模板进行核苷酸序列优化，去掉其铰链区的3个氨基酸AGP则为KL32的氨基酸序列，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于中国橡木蚕蛾的天蚕素B抗菌肽突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于中国橡木蚕蛾的天蚕素B抗菌肽突变体，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种核酸，所述核酸编码权利要求1所述的抗菌肽突变体。3.一种载体，所述载体包含权利要求2所述的核酸。4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求2所述的核酸或权利要求3所述的载体。5.权利要求1所述的抗菌肽突变体、权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗细菌感染疾病。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王嘉榕，孙红宾，赵宏鑫，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34