转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用技术

本方法是取转基因抗菌蛹蛆原料，冷冻粉碎裂制成匀浆，按比例加蒸馏水搅拌放入加层锅升温，使蛋白变性，降温抽滤除去蛋白，滤液用微孔滤膜除去残渣至透明液体，经两次超滤浓缩再除去大、小分子，最后过层析柱，使其药液抗菌肽活性蛋白纯度达９５％，经各项指标检定符合兽用基因生物药品和抗菌肽饮料添加剂的要求。取代兽用抗菌素对动物感染性疾病的治疗和常用抗菌素饲料添加剂，减少动物体内存留抗菌素的残留量对动物给人类的危害。因为抗菌肽它不但抗菌谱广，疗效确实，无抗药性和无毒副作用，而且分子量小，无过敏原，能耐热，性能稳定，易于贮藏，用量小，以微克计算，可作用于多种途径。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用转基因蝇蛆提取抗菌肽属于基因工程生产抗菌肽药品和生物饲料添加剂的
，特别是从转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用。在自然界，苍蝇是传播疾病的重要媒介害虫，能给人、畜传染多种疾病，但自身并不染病。苍蝇对恶劣环境具有极强的适应能力和有效的防御机制。大量研究证实，任何病菌在苍蝇体内的存活最多不超过7天，而只要有万分之一浓度的苍蝇抗菌物质，就可以杀死多种病菌，其效力是目前人类已发现的任何一种抗菌素所无法比拟的。在目前不少病原菌对已有抗生素逐渐产生耐药性，而新的抗生素发现又极为困难，苍蝇抗菌肽不乏是抗菌素的最佳选择。苍蝇的抗菌肽具有广谱抗菌活性，可以成为新一代不会在人、畜体内形成抗药性的超级抗生素药物。兽用抗菌肽和动物饲料添加剂，它不仅关系到动物疾病防治和动物体本身和群体健康繁育去获得更大的经济效益和环境效益外，更重大的是社会效益，关系着人类的健康。对它的要求应当把它与人类要求看作同等重要或放在同等位置来认识和处理。因为它关系着人类食品结构的改变和人类健康的切身问题。美国的马盖宁制药公司于1987年开始致力于Magainin的商业性研制，马盖字(一种蛙皮肽)作为人用药。2000年批准上市后，当年销售额即达10亿美元。“马盖字”商品的问世，它不仅为人类新一代抗菌素打开大门，而且也为动物抗菌素开拓了广扩的前景。现代研究证实，抗菌肽广泛存在于动物(昆虫)，植物和微生物中，采用纯化方法难以获得大量的抗菌肽。我们将人工合成的一种外源性抗菌肽，采用基因工程方法实现转基因家蝇繁育蝇蛆获取抗菌肽为工厂化生产高含量抗菌肽奠定了坚实基础。本专利技术的目的是利用现代技术手段，转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法及其应用，包括抗菌肽饲料添加剂。转基因抗菌肽是一种新型的兽医生物制品，它是用生物技术包括上游技术(转基因抗菌肽工程蝇的构建)，涉及目的基因合成、纯化、测序、克隆、电转移技术导入受精卵；中游技术家蝇繁育、工程蝇筛选、蝇蛆诱导、收集、贮存；下游技术涉及到目标蛋白纯化、工艺放大、质量检测与检定，使其产品安全性、有效性、稳定性和时效性融为一体。转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，收集蝇蛆→蝇蛆抗菌肽含量测试→低温深冻、贮存原料→低温粉碎、制成超微匀浆→抽提去除杂质→分离纯化→鉴定各项指标→调配不同规格制品→半成品鉴定→成品分装。一、转基因抗菌肽家蝇与相关基因药物生产方法之比较。从基因的发现到转基因小鼠的问世，几乎经过了一个世纪，确实说明了影响深远的基础研究成果转化为应用技术的不容易。可是，一旦获得首创性突破，就会呈现迅猛发展趋势。自从“巨鼠”出世以后，转基因技术的研究犹如雨后春笋，国内外竞相研究，幻想与成果此起彼伏，不断出现，形成了科学幻想与现实同行之趋势。转基因动物作为一门只有十几年历史的高新技术成果，既具有深远的理论研究价值，以具有重大的应用价值。在转基因动物的实际应用方面，涉及生物医学、农牧业和药物产业等诸多方面，其价值之大，作用面之广已越来越被人们所认识。在基因药物质三个发展阶段中，其表达系统的层次是不一样的，即从原核细胞(细菌等)、真核细胞(人类或哺乳动物细胞)、再到个体，转基因动物是一种个体表达系统，也是最复杂、最具有前景的生物表达系统。目前对三种基因药物生产方式之比较，转基因药物成本和制药成本是最低的，而转基因蝇蛆抗菌肽又是转基因药物之中最低的。因此蕴含着巨大的经济效益。二、抗菌肽基因合成与克隆抗菌肽(Antibacterial Peptides,ABP)是昆虫等动物产生的一类对抗外源性病原体的肽类活性物质，研究发现它有广谱抗细菌、抗病毒的功能，对真菌、原虫也有作用，甚至有抗肿瘤活性。由于抗菌肽有重要的临床作用价值，其研究进展十分迅速，其中许多抗菌肽的cDNA已被克隆测序。用基因工程手段将抗菌肽基因导入动植物体内进行表达，可望用抗菌肽杀死侵入机体内的病原，建立高效抗病的转基因动植物，也可采用融合表达方式在E.coli-1的氨基酸序列，兼顾鱼类、昆虫和大肠杆菌偏爱的密码子，设计其基因序列，加上适宜基因工程操作的酶切位，经人工合成2条分别为92bp和91bp的寡聚核苷酸片段，互寂链延伸反应，EcoRⅠ酶切，将完整的Shiva-1基因反向克隆至Puc18载体，经PCR检测和序列分析，正确的克隆了抗菌肽Shiva-1基因，为E.coli融合表达及转基因蝇蛆抗菌肽提供了关键技术环节。三、用转基因技术及抗菌肽基因导入家蝇受精卵以抗菌肽Shiva-1基因为基靶基因，利用BAEKON6000型基因转移仪进行了家蝇转基因是将收集家蝇(Musca Domcstica)新产受精卵(1-1.5小时内)，在脉冲电压(Amplitude)1500V、脉冲时间(Bvrust Time)1500ms、脉冲数(Number of Pluscs)1000、脉冲宽度(Pulse Width)100us、周期(Cycle)50、距离(Distance)2mm、PH值6.0-8.0及离子浓度为0.001-0.01μmol/L缓冲液等条件下，将10μg/ml环状质粒DNA与家蝇卵混合后进行转移，取转移后人工孵化24-36小时的家蝇幼虫，提取染色体DNA，通过PCR特异片段扩增及Southern检测，证明抗菌肽Shiva-1基因在家蝇染色体上实现了整合，而且遗传至子代。应用本方法建立的电转移条件对家蝇进行基因转移，成活率在20-40％之间，外源基因在成活家蝇的整合率在10％左右，同时本法具有操作简便、快速等特点。只要十几分钟就能完成数百枚卵的基因导入。四、转基因抗菌肽家蝇蝇蛆的饲养将转基因抗菌肽幼蛆接种放入已配合好的蝇蛆饲料中，饲料配方按麦麸、奶粉、白糖、米粉、豆饼粉，使配料松软透气，也可适度增加酵母及蛋白质的含量，以利幼蛆的生长与发育。先将配好的饲料置于饲养盒(框)中，厚度以不超过4-5公分为好，后用接种小铲将孵化盒中所孵化出的一龄幼蛆(种子)铲出并慢慢放入饲养盒中的饲料上，接种量不可过密，也不能过稀。幼虫(蛆)在饲养盒中吃饲料时，一般是自上而下，若饲养盒中的培养物要注意温度、湿度和PH值以及室内光线和通气。要随时检查，温度、湿度和PH值，饲料及蝇蛆的密度，及时调整为最佳状态。幼蛆从卵孵化出，体长约2毫米，24-36小时幼蛆进行第一次蜕皮，再经过一次蜕皮成为老熟幼虫，此时体长可达12-14毫米，整个幼虫期为5-8天。成熟的老熟幼虫(蛆)即停止取食，改变趋向，静止化蛹。饲养人员可及时给予这样的环境使之化蛹保种。同时，大量成蛆(老熟幼虫)分离出来加入适度缓冲液，降低含氧量，并超声波方法进行诱导之后，贮存于低温冷冻作为产品原料或商品贮存备用。种蝇培养要在严密隔离下，取原种在良种繁育室中繁育，至少选取1000对或1000对以上的优良个体混合接种作为原种和原种三级扩繁根据种性对原原种从形态学上逐个选择，以保证种的纯度。为保证种群遗传稳定性，种群大小应保持在1000对或1000对以上，留种时采用多家系混合接种。原原种的下一级为原种，原种的种群大小可根据生产的规模而定，在原种生产过程中应不断淘汰不良个体。原种的下一下为生产种。种蝇培养过程中，防止自然界中野生种混入。成虫饲养采用笼养法原种蛹在羽化之前本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因抗菌肽蝇蛆中制备兽用基因抗菌肽药品的方法，收集蝇蛆→蝇蛆抗菌肽含量测试→低温深冻、贮存原料→低温粉碎、制成超微匀浆→抽提去除杂质→分离纯化→鉴定各项指标→调配不同规格制品→半成品鉴定→成品分装。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苟仕金，苟鸿鹰，王成余，
申请(专利权)人：辽宁天成生物制药研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]