提供了带有突变膜蛋白基因的病毒的制备方法，以及用该方法所获得的病毒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求于2003年4月23日申请的美国申请顺序号60/464,776和2003年4月24日申请的美国申请顺序号60/465,328的权益，所述申请记载的内容通过引用结合到本文中。政府权利声明本专利技术是在美国政府资助下完成的(美国国立卫生研究院(theNational Institutes of Health)的资助号为AI-47446)。美国政府在本专利技术中可以享有一定的权利。
技术介绍
细胞膜由双层脂质分子组成，其中镶嵌着各种蛋白。因其疏水的内部，细胞膜的脂双层对大多数极性分子的通过起到屏障作用，因而对细胞活力至关重要。为了促进水溶性小分子进出细胞或胞内区室的转运，细胞膜具有载体蛋白和通道蛋白。对于包括肌细胞电兴奋性和神经系统电信号传导在内的许多细胞功能来说，离子通道是必不可少的(有关综述参见Alberts等，1994)。它们不仅存在于所有动植物细胞和微生物细胞中，而且在病毒中也已鉴定出它们的存在(Ewart等，1996；Piller等，1996；Pinto等，1992；Schubert等，1996；Sugrue等，1990；Sunstrom等，1996)，据此认为它们在病毒生命周期中起到重要作用。甲型流感病毒是有包膜的负链病毒，并且具有8个RNA区段，其上包裹着核蛋白(NP)(有关综述参见Lamb和Krug，1996)。有3种蛋白跨越病毒膜血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2。HA和NA的胞外结构域(胞外域)极易变异，而M2的胞外域在甲型流感病毒中基本上不变异。病毒的生命周期通常包括与细胞表面受体的结合，进入细胞和病毒核酸脱壳，随后病毒基因在细胞内复制。当合成病毒蛋白和基因新拷贝后，这些组分装配成子代病毒颗粒，随后从细胞中释放(有关综述参见Roizman和Palese，1996)。不同的病毒蛋白在这些步骤的各步起作用。在甲型流感病毒中，认为具有离子通道活性的M2蛋白(Pinto等，1992)在病毒生命周期的早期即穿入宿主细胞和病毒RNA脱壳之间起作用(Martin和Helenius，1991；有关综述参见Helenius，1992；Sugrue等，1990)。据信，一旦病毒体经过胞吞作用，病毒体相关M2离子通道(一种同型四聚体螺旋束)就允许质子从胞内体流到病毒体内部，以破坏酸不稳定M1蛋白-核糖核蛋白复合体(RNP)的相互作用，从而促进RNP释放到细胞质中(有关综述参见Helenius，1992)。另外，在HA在细胞内被切割的某些流感病毒株(例如A/fowl plagues/Rostock/34)中，其M2离子通道被认为会升高跨高尔基体网络的pH，从而避免了在此区室由于低pH条件引起的HA构象变化(Hay等，1985；Ohuchi等，1994；Takeuchi和Lamb，1994)。通过有爪蟾蜍(Xenopus laevis)卵母细胞表达M2蛋白并测量膜电流，证实了该蛋白具有离子通道活性(Pinto等，1992；Wang等，1993;Holsinger等，1994)。M2蛋白跨膜(TM)结构域的特定变化改变了通道的动力学特性和离子选择性，为M2 TM结构域构成离子通道孔提供了强有力的证据(Holsinger等，1994)。事实上，M2 TM结构域自身就可以起到离子通道的作用(Duff和Ashley，1992)。人们认为，M2蛋白离子通道活性在流感病毒生命周期中是必不可少的，因为阻断M2离子通道活性的盐酸金刚烷胺(Hay等，1993)，能抑制病毒复制(Kato和Eggers，1969；Skehel等，1978)。乙型流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员，其基因组由8个负链RNA区段组成，并且编码11种蛋白。在甲型流感病毒中也发现了其中的9种3种RNA依赖性RNA聚合酶亚基(PB1、PB2和PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1)和2种非结构蛋白(NS1和NS2)。NB和BM2两种蛋白是乙型流感病毒所特有的。RNA区段6编码NB，也编码NA，而区段7编码BM2。乙型流感病毒NB蛋白是III型膜内在蛋白，其在病毒感染的细胞表面上大量表达(Betakova等，1996；Shaw等，1983；Shaw等，1984)，并且掺入到病毒体中(Betakova等，1996；Brassard等，1996)。这种小蛋白(100个氨基酸)具有18个残基的N-端胞外域，22个残基的跨膜结构域和60个残基的胞质尾(Betakova等，1996；Williams等，1986)。根据以前测量膜电流的研究并根据甲型流感病毒M2蛋白进行类推(Fisher等，2000；Fisher等，2001；Sunstrom等，1996)，认为NB的功能是作为离子通道蛋白。然而，基于脂双层系统的NB蛋白电生理学测定是难以中断的。换句话说，含有疏水结构域的蛋白和肽(据信在细胞中缺乏离子通道活性)在脂双层中能产生通道记录(Lear等，1988；Tosteson等，1988；Tosteson等，1989)。此外，在Fischer等(2001)和Sunstrom等(1996)的研究中，金刚烷胺被用来证明NB蛋白通道活性的缺乏，尽管该药物并不能抑制乙型流感病毒复制。因此，现有的证据挑战了NB蛋白具有离子通道活性的说法。针对病毒感染的免疫力取决于响应感染细胞表面或病毒体上存在的抗原的免疫应答的产生。如果知道了这些表面病毒抗原，就可以成功地生产出疫苗。尽管在表面有多种抗原，但其中只有某些抗原才产生中和免疫性。生产疫苗的方法之一是使病毒“减毒”。通常的做法是将感染性病毒传代到外源宿主并鉴定超强毒株。通常，这些在外源宿主中的超强毒株在原始宿主细胞中毒性要弱些，因而是良好的候选疫苗，因为它们产生以体液IgG和局部IgA形式的良好的免疫应答。通常从培养至高滴度的活病毒、减毒病毒或灭活病毒来制备流感疫苗。活病毒疫苗能激活免疫系统的所有时相并刺激针对每种保护性抗原的免疫应答，这避免了制备灭活疫苗时要选择性地破坏保护性抗原的困难。另外，由活病毒疫苗产生的免疫性通常比灭活疫苗更持久、更有效、更具有交叉反应性。此外，活病毒疫苗的生产成本比灭活病毒疫苗更低廉。然而，减毒病毒中的突变通常并不清楚，并且这些突变看来是在病毒抗原基因中。因此，所需要的是制备供疫苗用的重组减毒流感病毒的方法，所述病毒例如是具有确定突变的减毒病毒。专利技术概述本专利技术提供一种分离和/或纯化的重组流感病毒，所述病毒包含突变膜蛋白基因，例如突变膜内在蛋白基因，例如突变III型膜内在蛋白基因，所述基因不编码功能性膜蛋白或其功能性部分。本专利技术也提供一种分离和/或纯化的重组流感病毒，所述病毒缺乏膜蛋白基因。重组流感病毒中缺乏功能性膜蛋白(例如膜内在蛋白)，提供了在体外能复制但在体内被减毒的重组流感病毒。在一个实施方案中，所述重组病毒包含突变膜蛋白基因，所述基因包含一个或多个突变，当所述基因在细胞中转录和/或翻译时，不能产生功能性膜蛋白或其功能性部分。在另一个实施方案中，相对于编码功能性膜蛋白的相应膜蛋白基因来说，所述突变膜蛋白基因包含至少两个突变，其中至少一个突变不在对应于所述蛋白跨膜结构域的区域内。例如，所述突变膜蛋白基因，当在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的重组流感病毒，所述病毒包含不编码功能性膜蛋白或其功能性部分的突变膜蛋白基因，其中相对于编码功能性膜蛋白的相应膜蛋白基因来说，所述突变膜蛋白基因包含至少两个突变，其中的一个突变不在对应于跨膜结构域的膜蛋白基因区内。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：河冈义裕，
申请(专利权)人：威斯康星旧生研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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