人α２干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明专利技术利用重叠ＰＣＲ技术，连接ＩＦＮα ２ ｃＤＮＡ和ＨＳＡ ｃＤＮＡ，中间不加入任何连接肽，得到的ＨＳＡ－ＩＦＮα ２ ｃＤＮＡ融合基因被整合到宿主的染色体中进行表达；本发明专利技术的融合蛋白包括与人α２干扰素至少８５％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少８５％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人α２干扰素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物
技术介绍
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640119-128)。David S.Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48169-174)。细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，它包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU_HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，198537161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。人干扰素(Interferon，IFN)分为I型和II型两类，I型干扰素主要包括IFNα、IFN β，两者共用同一个受体，且对热和pH的耐受能力较强。II干扰素包括IFN γ。IFN α是有由白细胞产生，包括至少25种以上的亚型，这些亚型具有相似的结构特点分子量均在16～27.6kDa之间，等电点约5～7，氨基酸残基数165和166，有两对二硫键(C1-C98，C29-C138或C1-C99，C29-C139)，二硫键对IFN α蛋白的正确折叠和生物学活性十分重要，只有少数几个IFN α亚型有糖基化。本专利技术所涉及的IFN α2，为IFN α家族中的成员，它存在三形式，即IFN α2a、IFN α2b和IFN α2c，因为它们具有优越的抗病毒、抗肿瘤和调节机体免疫功能而被广泛地应用于治疗病毒性疾病和肿瘤。临床上常用的IFNα2a和IFN α2b，由于分子量较小，易被肾小球滤过，从而导致它的血浆清除率高、体内半衰期短(皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在8小时左右)，生物利用度低。为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药，如隔日一次，每次8×106IU，而慢性病毒性肝炎周期较长(一般在六个月以上)，频繁大剂量用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且容易产生毒副作用。为了克服上述缺点，可以对干扰素加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有剂型改造、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段，将其与其它大分子蛋白融合。Tse Wen Chang等利用干扰素与人免疫球蛋白IgG的Fc融合以达到延长半衰期的目的(Tse Wen Chang et al.，美国专利US5908626，1999-01-01)。由于人IgG存在同种异型，在用药者体内可能产生相应的抗体而降低该融合蛋白的疗效，本专利技术拟将α2干扰素与人血清白蛋白融合。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本专利技术的融合蛋白在保持了人α2干扰素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。本专利技术的技术方案人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备是IFNα2 cDNA通过RT-PCR从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞RNA中直接扩增得到；HSA cDNA通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得；获得的IFN α2cDNA和HSAcDNA分别插入到克隆载体中，测序。利用重叠PCR技术，连接IFN α2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IFN α2cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-IFN α2cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达。IFNα2 cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，IFNα2 cDNA和HSA cDNA的连接，融合蛋白HSA-IFN α2的酵母表达系统构建和融合蛋白HSA-IFN α2的表达的步骤详见实施例。用上述方法制备的人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人α2干扰素至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人α2干扰素同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人α2干扰素同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。优选的是所述融合蛋白包括与人α2干扰素至少95％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第二区。所述融合蛋白的第二区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括其所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名为HSA(1-n)，n为369-419。所述融合蛋白包括与人α2干扰素氨基酸残基序列相同的第一区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。宿主表达系统是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞表达系统。优选的宿主表达系统是酵母。优选的酵母是毕赤酵母。优选的毕赤酵母是毕赤酵母KM71。IFN α2 cDNA可以通过RT-PCR从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞RNA中直接扩增得到。HSA cDNA可以通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得。IFN α2cDNA和HSA cDNA也可以通过人工合成的方法获得。该法可以人为地选择宿主偏好的密码子，以使目的基因高效表达。获得的IFN α2 cDNA和HSA cDNA分别插入到克隆载体中，测序。利用重叠PCR技术，连接IFN α2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IFN α2cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存。IFN α2cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多个系统中表达，如细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，及生物体(如脊椎动物、昆虫等)等。在这些表达系统中目的基因被整合到宿主的染色体中或插入到质粒中。本专利技术优选的是酵母表达系统，该系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大本文档来自技高网...
【技术保护点】
人α２干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是ＩＦＮα２ｃＤＮＡ通过ＲＴ－ＰＣＲ从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞ＲＮＡ中直接扩增得到；ＨＳＡｃＤＮＡ通过ＰＣＲ从人胎肝ｃＤＮＡ文库中扩增获得；获得的ＩＦＮα２ｃＤＮＡ和ＨＳＡｃＤＮＡ分别插入到克隆载体中，测序；利用重叠ＰＣＲ技术，连接ＩＦＮα２ｃＤＮＡ和ＨＳＡｃＤＮＡ，中间不加入任何连接肽，得到的ＨＳＡ－ＩＦＮα２ｃＤＮＡ融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将ＨＳＡ－ＩＦＮα２ｃＤＮＡ融合基因整合到宿主的染色体中进行表达；（１）ＩＦＮα２ｃＤＮＡ的克隆：取正常人外周血加淋巴细胞分离液，分离出人血白细胞，用含有５％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基稀释至细胞浓度为５×１０↑［７］个／ｍｌ，加入新城鸡瘟病毒到１００血凝单位／ｍｌ，３７℃，５％ＣＯ↓［２］，培养１小时，使病毒吸附在细胞上，１０００×ｇ离心弃上清，加入新鲜的有５％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基，３７℃，５％ＣＯ↓［２］，培养１８小时；用ＲＮＡ提取试剂盒分离总ＲＮＡ，用一步法ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒反转录为ｃＤＮＡ并从中扩增出ＩＦＮα２，所用的引物如下：Ｐａ２ｂ１：５’－ＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡ－３’Ｐａ２ｂ２：５’－ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴ－３’一步法ＲＴ－ＰＣＲ反应体系配制如下：１０×ｏｎｅｓｔｅｐＲＮＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒ５μｌ２５ｍＭＭｇＣｌ↓［２］１０μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ５μｌＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）１μｌＡＭＶ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄＴａｑ１μｌＡＭＶＲＴａｓｅＸＬ（５Ｕ／μｌ）１μｌ１０μＭＰａ２ｂ１２μｌ１０μＭＰａ２ｂ２２μｌ提取的总ＲＮＡ１μｌＲＮａｓｅＦｒｅｅＨ↓［２］Ｏ２２μｌ总体积５０μｌ反应条件为：５０℃３０分钟，９４℃变性２分钟，９４℃变性１分钟，５５℃退火１分钟，７２℃延伸９０秒，循环３０次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带；用ＰＣＲ片段胶回收试剂盒纯化出０．５ｋｂ的目标片段；纯化好的目标片段和载体ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔⅡＫＳ（＋），经ＳａｌⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用ＰＣＲ片段胶回收试剂盒回收；用Ｔ↓［４］连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，转化物涂布于含有Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ和１００μｇ／ｍｌ氨苄青霉素的ＬＢ琼脂...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，雷楗勇，杨健良，张莲芬，窦文芳，徐钰，李洁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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