用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种PAM抑制剂技术

本发明专利技术涉及一种用于蛋白表达的细胞培养基，该培养基包括PAM抑制剂或其生理等同物，还涉及一种用于蛋白表达的细胞培养方法，在该方法中，PAM抑制剂或其生理等同物被使用。

A cell culture medium and method for protein expression, the medium and method including a PAM inhibitor

The invention relates to a method for protein expression in cell culture medium, the culture medium including PAM inhibitors or its physiological equivalent, also relates to a culture method for protein expression in cells, in this method, PAM inhibitors or its physiological equivalent is used.

【技术实现步骤摘要】
用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种PAM抑制剂本申请是申请号为201180053542.X，申请日为2011年11月09日，名称为“用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种PAM抑制剂”的分案申请。
本专利技术涉及包含PAM抑制剂或其生理等同物的细胞培养基和培养方法。
技术介绍
虽然蛋白质的主要特征是它们的氨基酸序列(一级结构)，其它方面，如转译后修饰，也贡献蛋白质的一些特性，影响二级，三级和四级结构。一些转译后修饰对后期蛋白质活性发挥了显著作用，包括生物药品的安全性和有效性。蛋白质异质性的一个主要方面是电荷分布，其包括酸性变种，例如通过氨基酸如天冬酰胺的脱酰胺化，通过糖基化或通过N-末端谷氨酰胺到焦谷氨酸，以及基本的变种的处理，及例如，C-末端赖氨酸的变体和酰胺化的氨基酸，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基以形成。C-末端脯氨酸酰胺残基的形成，在某些情况下，然而，是不需要的，例如，如不希望的异质性的来源，或所述变种潜在影响蛋白质的活性或免疫原性的情况下，或当酰胺化氨基酸的量，如脯氨酸酰胺，在蛋白质里相对参考蛋白质被生产的过高或过低。相对于在高度可控的物理化学条件下生产的小分子药物，蛋白质的生产，特别是用作生物治疗药物的蛋白质的生产，是一个非常复杂的问题，是很难控制的，因为生产利用活细胞培养系统。因此，重要的是手边有一个工具箱，允许控制，特别是生产蛋白质的转译后修改，为了能够提供稳定的产品质量和稳定的高产出率，提高生产过程的效率，增加，和/或微调生产的蛋白质的生理活性和派生药物的安全，和/或匹配生产蛋白质和参考蛋白质的转译后特性。本专利技术的目的是提供一种用于蛋白质表达的方法和培养基来满足这些要求。这些目的是通过根据本专利技术的独立权利要求的方法和手段来满足。从属权利要求与优选的实施例相关。应当理解的是被数值界定的数值范围被理解为包括所述端点值。
技术实现思路
在本专利技术被仔细描述前，应当理解，本专利技术并不局限于描述装置的特定部件或描述方法的步骤，因为这些装置和方法可能改变。也应当理解的是，本专利技术所用的术语目的只是描述特定的实施例，并不意在对其进行限制。必须指出的是，用在说明书和附属权利要求中的单数形式“一”，“一个”和“该”包括单数和/或复数对象，除非上下文中另有明确规定。而且应当理解的是，如果参数范围被给定，通过数值来界定，该范围被视为包括这些端点值。根据本专利技术的第一方面，提供一种用于蛋白质表达的细胞培养基，该培养基包括一种PAM抑制剂或其生理等同物。根据本专利技术的另一方面，提供一种用于蛋白质表达的细胞培养方法，在该方法中，一种PAM抑制剂或生理等同物被使用。PAM(肽α-酰胺单加氧酶)是一种多功能蛋白，其含有两个顺序作用的酶的活性来催化C-末端截断和α-酰胺化的肽。肽α羟基化单加氧酶(PHM)催化该反应的第一步，并依赖于铜(Cu)或铜离子，抗坏血酸盐和分子氧。依赖锌的肽基酰氨基甘醇酸酯裂解酶(PAL)催化该反应的第二步骤，酰胺化的C-末端脯氨酸酰胺。PAM抑制剂是降低PAM复合物催化率的物质。Chew(2003)表明PAM抑制剂可能是有用的抗增殖药物，而Bauer等(2007)表明，一些PAM抑制剂具有抗炎作用。然而，到目前为止，在细胞培养基或培养方法中使用PAM抑制剂，特别在基因表达中，更特别在异源蛋白质的表达中没有被描述。PAM抑制剂的一些例子，在下面的表中提到：·S-(硫代苯甲酰基)巯基乙酸·N-(苯硫基乙酰基)丙氨酸·S-(4-甲硫基苯甲酰)巯基乙酸·4-氰基-4-甲基-4-硫代苯甲酰基-硫烷基丁酸·S-(4-甲硫基苯甲酰)巯基乙酸乙基酯·S-(N-苯氨基硫甲酰基)-3-巯基丙酸·S-(苯基硫代乙酰基)巯基乙酸·S-(N-苯氨基硫甲酰基)巯基乙酸·S-(3-苯硫基丙酰基)巯基乙酸·N-羟基酸苯基氨基甲酸乙酯·(D，L)-四氢噻吩·(苯硫基)乙酸·(2-硝基苯硫基)乙酸·S-(月桂硫代)巯基·双硫仑·亚硫酸钠·4-苯基-3-丁烯酸(PBA)·硫普罗宁·卡托普利·EDTA·亚硫酸铵·氢化肉桂-苯丙氨酰基-高半胱氨酸如上所述，上述PAM抑制剂的生理等同物也被本专利技术包括。在本专利技术的一个优选实施例，上述表达式一个异源蛋白质的表达。在本专利技术的另一优选实施例中，所述异源表达发生在基于哺乳动物细胞的表达系统。优选的，所表达的蛋白质是选自下列组成的组中的至少一种蛋白质，该组组成为：·抗体，或该抗体的片段或衍生物·融合蛋白，和/或·非抗体蛋白。优选的，根据本专利技术的培养方法和培养基适合(充足)生产蛋白质，其包括氨基酸序列相同或实质上类似的全部或部分的下列蛋白质：Flt3配体，CD40配体，红细胞生成刺激蛋白如促红细胞生成素(EPO)，达依泊汀，包括慢性肾病，和血小板生成素，降钙素，瘦素，Fas配体，受体活化NF-κB的配体(RANKL)，肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)，胸腺基质衍生的淋巴细胞，粒细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，生长因子包括肥大细胞生长因子，干细胞生长因子，表皮生长因子，角质细胞生长因子，巨核细胞生长和发育因子，趋化因子，生长激素，胰岛素，促胰岛激素，类胰岛素生长因子，甲状旁腺激素，干扰素，包括α-干扰素，β-干扰素，和γ-干扰素，神经生长因子，脑源性神经营养因子，突触结合蛋白样蛋白(SLP1-5)，神经营养因子-3”胰高血糖素，白细胞介素IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17和IL-18，集落刺激因子，淋巴毒素-对，肿瘤坏死因子(TNF)，白血病抑制因子，制瘤素M，和各种配体的细胞表面分子ELK安利马赫(如弗激酶或LERKS的配位体)。此外，通过使用本专利技术的培养方法和培养基，蛋白质能够被生产，包括蛋白质包括任一上述蛋白质受体的全部或部分氨基酸序列，任何上述蛋白受体的拮抗剂，和蛋白质基本上类似于这样的受体或拮抗剂。另外，使用本专利技术的方法和培养基可以生产蛋白质，包括蛋白质，包括分化抗原(简称CD蛋白)的全部或部分氨基酸序列或它们的配体或蛋白质基本上类似的任一这些。这种抗原的例子是分化抗原，包括CD20，CD22，CD27，CD30，CD39，CD40和配体。也可以使用本专利技术的方法和培养基生产酶活性蛋白质和它们的配体。例子包括蛋白质，其包括全部或部分的下列蛋白质之一，或它们的配体，或蛋白质基本上类似于其中一个：金属蛋白酶去整合素家族成员，激酶，葡糖脑苷脂酶，超氧化物歧化酶，组织型纤溶酶原激活剂，凝血因子VIII，因子IX，载脂蛋白E，载脂蛋白A-1，球蛋白，IL-2受体拮抗剂，α-1抗胰蛋白酶，肿瘤坏死因子-α转换酶，任何上述酶的配体，和许多其他的酶和它们的配体。本专利技术的方法和培养基，也可用于生产在体外选择要绑定到一个特定的目标蛋白的嵌合蛋白质，并修改其活性，和抗体或其部分，嵌合抗体，即抗体具有人类不变抗体免疫球蛋白域耦合到一个或多个鼠可变抗体的免疫球蛋白结构域，及其片段，或实质上类似的蛋白质。本专利技术的方法也可用于生产包含抗体和细胞毒性或发光物的共轭物。抗体的实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其中PAM抑制剂用作细胞培养基的组分，其中所述PAM抑制剂减少酰胺化氨基酸残基的形成量。

【技术特征摘要】
2010.11.09 EP 10190532.11.一种用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其中PAM抑制剂用作细胞培养基的组分，其中所述PAM抑制剂减少酰胺化氨基酸残基的形成量。2.如权利要求1所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括在所述细胞培养基中培养表达异源蛋白质的细胞，其中所述细胞培养基包括进料溶液，其中所述进料溶液还包括PAM抑制剂。3.如权利要求2所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其特征在于，所述PAM抑制剂是浓度为100μM的PBA，其中所述PAM抑制剂在所述进料溶液中的浓度≤3M。4.如权利要求1至3中任意一项所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法，其特征在于，所述酰胺化氨基酸残基是C-末端脯氨酰胺残基。5.一种用于如权利要求1至4中任意一项所述的用于蛋白质的异源表达的细胞培养方法的细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基目的在于减少酰胺化氨基酸残基的形成量，所述细胞培养基包括进料培养基和PAM抑制剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：科琳娜·松德雷格，朱莉娅·思科牧兹哈德，克莉丝汀·希尔，托马斯·斯坦格勒，
申请(专利权)人：山德士公司，
类型：发明
国别省市：奥地利,AT