本发明专利技术公开了叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4D3，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，编码如SEQIDNO.7所示的氨基酸序列，还公开了含有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的重组载体，本发明专利技术公开的剪接异构体FR4D3编码的蛋白质可以作为细胞分选的标记物，具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW，还涉及该剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质和应用。
技术介绍
叶酸受体(folate receptor, FR)是一种叶酸结合蛋白，这些受体的表达对于细胞从血衆中摄取叶酸非常重要。人的叶酸受体有四种亚型，分别为FR-α，FR-β , FR-Y和FR - δ。其中FR-α主要表达在上皮细胞，对叶酸(folate, acid FA)的亲和力较强；FR-^只表达在活化的巨噬细胞表面和起源于造血细胞的恶性肿瘤细胞表面；FR-y被证实是一种造血组织的分泌蛋白，对叶酸的亲和力比FR-α低很多；FR_S在人的组织中表达量低， 很难在组织中被发现，其可能在调节性T细胞表面表达。在小鼠中，FR-α被称为叶酸结合蛋白I (Folbpl或FRl)，FR-β被称为叶酸结合蛋白2 (Folbp2/FR2)，叶酸结合蛋白3 (Folbp3)，也称为FR4，与人FR- δ高度同源，具有调节叶酸摄取的功能，同时FR4还与免疫相关，如FR4可以诱导脾脏和胸腺相关的淋巴组织和淋巴细胞。调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)对于维持自身的免疫耐受和体内免疫自稳非常重要。在对Tregs的分子标记进行研究时发现FR4在天然Tregs上高表达，而且在维持细胞表型中起着非常重要的作用。在以前的研究中，我们鉴别了一种FR4 mRNA剪接异构体，其保留了野生型FR4基因的内含子3，简称为FR4v。目前，FR4的其他mRNA剪接异构体未见报道，发现FR4的mRNA剪接异构体为研究细胞的免疫调节和摄取叶酸奠定基础，同时为细胞分选提供更多的标记物。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW ；本专利技术的目的之二在于提供mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质；本专利技术的目的之三在于提供含mRNA剪接异构体FR4/W的重组表达载体；本专利技术目的目的之四在于提供叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质的应用。为实现上述专利技术目的，技术方案为I.叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。2.所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 7 所示。3.含所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW的重组表达载体。优选的，所述重组载体由叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W用XhoI和XbaI酶切后与经同样酶切的pCI-neo载体连接而成。4.所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W编码的蛋白质在细胞分选中作为细胞标记物的应用。本专利技术中的剪接异构体是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。本专利技术的有益效果在于本专利技术公开了叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W，为叶酸结合蛋白3新的剪接异构体，与叶酸结合蛋白3成熟的mRNA相比却失189bp的外显子3，根据三联密码子原理删除189bp后不会改变FR4的正确翻译，因此本专利技术获得的mRNA剪接异构体FR4/W能正确翻译为分子量为21kDa的蛋白质。FR4/W蛋白作为一种新蛋白质，能够作为细胞筛选的新标记物，同时为研究细胞对叶酸的摄取和免疫调节奠定了理论基础。附图说明 图I为FR4基因及其剪接异构体的PCR扩增结果。图2为FR4ZW的核苷酸与氨基酸的对照图。图3为小鼠脾细胞蛋白印迹结果图。图4为分离纯化的脾脏T细胞亚群结果图。图5为F0XP3阳性的⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群结果图。图6为RT-PCR分析脾脏T细胞亚群、⑶4+ T淋巴细胞亚群和⑶4+CD25+ T淋巴细胞亚群中FR4，FR4v和FR似？的mRNA表达水平结果图(第一泳道为Marker ;第二泳道为⑶4+CD25+ T淋巴细胞亚群，第三泳道为⑶4+ T淋巴细胞亚群，第四泳道为脾细胞亚群)。图7为分选的⑶8+T淋巴细胞、⑶4+CD25T淋巴细胞和⑶4+⑶25+T淋巴细胞中FR似 和FR4蛋白的蛋白表达结果(第一泳道为⑶8+T淋巴细胞亚群蛋白印记；第二泳道为⑶4+CD25—T淋巴细胞亚群蛋白印记；第三泳道为⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群蛋白印记)。图8为不同浓度的叶酸刺激⑶4+⑶25+ Tregs细胞增殖能力结果图(叶酸浓度分别为 O ng/mL, 2 ng/mL, 4 ng/mL, 6 ng/mL, 8 ng/mL 和 10 ng/mL)。图9为转染pCI-neo-FR4和pCI-neo_FR4/W质粒的细胞中FR4蛋白和FR4ZW的表达量。图10为⑶3抗体、⑶28抗体、IL-2和FA刺激条件下，对过表达FR4和FR似？蛋白细胞的增殖力影响结果图。具体实施例方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例I FR4不同剪接异构体的克隆与分析 实验材料为6到8周的雌性BALB/c小鼠，购买于中国医学科学院实验动物研究所(北京)，将购买的实验小鼠在无菌的条件下进行饲养。利用TRIzol 试剂盒(Invitrogen,USA)从BALB/c小鼠的脾细胞中提取RNA，然后将制备的RNA逆转录为第一链cDNA，具体步骤按RT-PCR试剂盒(TaKaRa，Japan)说明书进行。根据报道的小鼠的叶酸结合蛋白3 (命名为FR4)基因序列(Genbank No.NM_022888)设计扩增FR4基因编码序列(coding sequence, CDS)的引物，上游引物为 mFR4_F :5’-atggcacagtggtggcagat-3’ (SEQ ID NO. I),下游引物为 mFR4_R :5’-tcagggatggaacaacaggc-3’(SEQ ID NO. 2)。以制备的第一链 cDNA 为模板，mFR4_F 和mFR4-R分别为上、下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为98°C 10秒，68°C 40秒，30个循环。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示。由图I可知，PCR扩增产物有3条目的片段，分别回收3条目的片段，然后分别连接pMD19-T载体，连接反应按试剂盒说明书进行。将PCR扩增产物亚克隆入pMD19-T载体后，送生工生物工程(上海)有限公司测序。测序结果显示，利用mFR4-F和mFR4-R为引物进行PCR扩增获得的3条目的条带，为FR4基因mRNA的3种不同剪接异构体，分别为具有735 bp的FR4编码序列(简称为FR4)、具有843bp的多了内含子3的FR4 (简称为FR4v)和具有546bp的缺少外显子3的FR4 (简称为FR4ZW)，其中FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，FR4ZW的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示。对FR4ZW核苷酸序列分析显示，编码546核苷酸的序列相当于FR4缺失189bp的外显子3的核苷酸序列，缺失189bp的外显子3为FR4的6本文档来自技高网...
【技术保护点】
叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4D3，其特征在于：所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4D3的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W，其特征在于所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR似？的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。2.权利要求I所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氣基酸序列如SEQ ID NO. 7所不。3.含权利要求I所述mRNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：田易，倪兵，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：
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