一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法技术

本发明专利技术公开了一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，该方法以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为原始材料，对外植体进行愈伤组织诱导、继代培养，建立悬浮细胞系，通过悬浮细胞系诱导不定根，通过不定根的稳定性培养、继代保存、培养条件优化，即可用于扩大培养生产雷公藤甲素和生物碱。该方法得到的不定根中雷公藤甲素和总生物碱的含量分别为根皮粉的１３倍和１．８倍，培养液中雷公藤甲素产量占５５～６０％，总生物碱产量占６０～６５％。利用该方法生产雷公藤甲素和总生物碱，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利于雷公藤自然资源的保护。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种雷公藤不定根培养方法，特别是一种由雷公藤悬浮细胞 诱导不定根的方法，该方法生产的雷公藤不定根中所含的雷公藤甲素和总生 物碱相对较高，具有生产周期短、效率高、对环境无污染等特点，并且有利 于雷公藤自然资源的保护。
技术介绍
雷公藤(7>i'/^e/y^'i/y77 w7/b/Y/h' Hook. f.)系卫矛科雷公藤属植物， 在我国很早以前就用于医学和防治各种害虫，为著名的杀虫植物之一。民间 多用于防治蔬菜害虫，故有"菜药"之称。其对多种害虫有效。传统中医上 可用于治疗肿胀、水肿、黄白疽、痢疾等，具有明显的抗肿瘤、抗风湿作用。 雷公藤属多年生木质藤本、生长缓慢、处于野生状态，因用根入药，大量应 用使资源遭到破坏。雷公藤根中的活性成分含量显著高于其他部位，是主要药用部位。现已 从中分离出70多种化学成分，其中雷公藤甲素又称雷公藤内酯醇，是中药 雷公藤的主要有效成分之一，作为免疫抑制药物，可应用于许多自身免疫性 疾病的治疗，同时它又是一种毒性成分。雷公藤生物碱具有明显的体液和细 胞免疫抑制作用，也是治疗类风湿性关节炎的有效成分。在农业害虫防治中， 雷公藤甲素有较好的触杀活性，雷公藤总生物碱有较好的胃毒毒杀活性和拒 食活性。这些有效成分均为次生代谢产物，在雷公藤植株内含量很低，在其 他植物内的含量更低，虽然可通过化学分离提取获得产品，但受气候、土壤、 分布等因素及有效成分含量、原料、季节等条件的限制，生产受到一定的限 制，加上人类对自然的过度开发，资源受到破坏，提取量很有限。雷公藤细胞培养生产有效成分在国内外已进行了大量研究。在国内，尹 作鸿等人从雷公藤的茎、叶诱导出愈伤组织，并进行了组织培养，从中分离得到雷公藤甲素、雷公藤乙素等二萜内酯化合物。曹华兴等(2002年)申请专利技术专利提出采用悬浮法培养雷公藤植物细胞而生产雷公藤总生物碱的方法，该方法得到的产物所含雷公藤总生物碱的含量为植物体的2.9倍。在 国夕卜，早在1980年美国乔治顿大学生物学DujackLW等采用细胞悬浮培养 法，并报告了组织培养中前体的影响。与此同时，加拿大学者J.PKutney等 也用雷公藤茎叶进行组织培养成功，把雷公藤内酯醇和雷公藤内酯二醇的产 最较f中含量分别提高了 3倍和16倍，并探索以托品类(Terpenoids)作为前 体物促进雷公藤内酯二醇的生物合成。MMjsawa等(1982年)报告了用含 蔗糖和植物激素的琼脂对雷公藤进行组织培养结果，经培养后的细胞所含雷 公藤内酯二醇比原植物含量高IO倍。日木KyowaHakkokogyo公司也为组 织培养生产雷公藤内酯醇和雷公藤内酯二醇申请专利。这些对雷公藤细胞培 养的研究从不同方面进行了有益的探索，但远未达到工业化生产的水平。而 关于雷公藤不定根悬浮培养法生产雷公藤甲素和总生物碱的方法尚未见到 报道。一般来说，植物的次生代谢产物在已经分化的组织中含量较高，且器官 培养相对比较稳定，因此采用苗或根培养的方法是生产次生代谢产物的另一 条途径。根培养对植物有着特殊的意义，因为许多植物次生代谢物均来自于 根部。但工业化培养生产根类的实例并不多，韩国目前在高丽参根类培养方 面已经取得了突破性进展，采用了 5 10t的反应器，并以培养的根为原料 开发了系列产品。用有一定的器官分化的不定根作为悬浮培养的材料，生产 其代谢产物，要比细胞培养有效成分要高得多，但不定根的诱导需要克服更 多技术上的困难，并非所有植物均可进行不定根诱导。植物细胞全能性的设想于1902年提出，1948年得到了证实，这为进行植物组织培养工作奠定了理论基础，自从1956年Routine和Nickel首次申 请用植物组织培养生产有用次生代谢产物的专利以来，应用细胞培养生产有 用的次生物质的研究取得了很大的进展。大量研究成果证明，通过植物细胞 发酵培养产生有用的次生代谢产物越来越显示出巨大的应用潜力。利用植物 细胞培养生产次生代谢产物不受地理、季节变换和各种环境因素的影响；可 节省土地，降低成本，縮短生产周期；可以提供一种标准化的生产过程，该 过程可以连续生产，产品的质量和产量稳定，便于实行工业化生产，已是解 决各种有效成分含量低的植物资源利用的主要途径。这是本申请的试验基础 和理论基础。
技术实现思路
为了保护雷公藤的自然资源，本专利技术的目的在于提供由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案 ，其特征在于，具体包括下列步骤步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体；用洗洁精洗 涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗2小时，用含70%质量分数的酒精消毒 20s，然后以无菌水冲洗4次，再用lg/L HgCl2消毒4 min，无菌水冲洗4 次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进 行愈伤组织诱导，培养基组成为MS+(0. 5 1.0)mg/L2，4-D+(0. 1 0. 5) mg/L KT， pH值为5. 8，并在培养基中加入蔗糖30 g/L，培养室温度为25土1 。C，保持每天12小时的光照，光照强度为1000 1500 lx， 20 30天后形 成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，40 45天继代一次，连续继代5代，培养基组成为6，7-V+1.0 mg/L 2， 4-D+0. 5 mg/L KT;步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为 5% 10% (w/v)，接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为 NT+1.0 mg/L 2, 4-D十O. 5 mg/L KT，选择250 mL三角瓶，装培养基100 mL， 放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为温度25+l°C，自然光照， 摇床转速120转/分钟，每25 30天继代培养一次，连续继代培养3次以上， 即获得雷公藤悬浮细胞系；步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在lmm以下、分 散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在NT培养基上进行不定根的诱导， 接种量为鲜重5g/L 10g/L，NT培养基的组成为NT+(0. 5 1. 0)mg/L 2， 4-D+ (2 6) mg/L NAA+ (0. 1 0. 5) mg/L KT，培养30天可产生不定根，继续 培养至45天，有85%的细胞团产生长度为0. 5cm 3cm的不定根；步骤六，不定根的稳定性培养继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱 导的不定根中，根长度为lcm 2cm、细胞团直径在2mm以下、分散性好， 富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在步骤五相同培养基 上连续培养5代以上，即可形成稳定的不定根培养体系；同时将筛选的生长 旺盛、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，继代保存在MS培 养基中，35天继代一次，MS培养基组成为O. 5 1.0 mg/L 2， 4-D、 NAA 2 6 mg/L， KT 0. 1 0. 5 mg/L，蔗糖30 40 g/L， pH值为5. 8;步骤七，对不定根进行生产培养时，在NT培养基中加入0.5 1.0mg/L 2,4-D、 NAA 2 6 mg/L， KT 0. 1 0. 5 mg/L，蔗糖25 g/L， pH值为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由雷公藤悬浮细胞诱导不定根的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：步骤一，以雷公藤一年生枝条扦插形成的不定根为外植体，用洗洁精洗涤并用自来水反复清洗后，流水冲洗２小时，用含７０％质量分数的酒精消毒２０ｓ，然后以无菌水冲洗４次，再用１ｇ／ＬＨｇＣｌ↓［２］消毒４ｍｉｎ，无菌水冲洗４次；步骤二，将不定根的幼根切成小段；接种在培养基上，放置在培养室进行愈伤组织诱导，培养基组成为：ＭＳ＋（０．５～１．０）ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋（０．１～０．５）ｍｇ／ＬＫＴ，ｐＨ值为５．８，并在培养基中加入蔗糖３０ｇ／Ｌ，培养室温度为２５±１℃，保持每天１２小时的光照，光照强度为１０００～１５００ｌｘ，２０～３０天后形成愈伤组织；步骤三，将形成的愈伤组织置入培养基中继代培养，４０～４５天继代一次，连续继代５代，培养基组成为：６，７－Ｖ＋１．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．５ｍｇ／ＬＫＴ；步骤四，挑选生长快、有光泽、质地疏松，颗粒状愈伤组织，接种量为５％～１０％（ｗ／ｖ），接种在培养基上建立雷公藤悬浮细胞系，培养基的组成为ＮＴ＋１．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋０．５ｍｇ／ＬＫＴ，选择２５０ｍＬ三角瓶，装培养基１００ｍＬ，放入培养室中的摇床上震荡培养，培养条件为：温度２５＋１℃，自然光照，摇床转速１２０转／分钟，每２５～３０天继代培养一次，连续继代培养３次以上，即获得雷公藤悬浮细胞系；步骤五，用对数期生长的雷公藤悬浮细胞系，选取直径在１ｍｍ以下、分散性好、颗粒状雷公藤悬浮细胞系转接在ＮＴ培养基上进行不定根的诱导，接种量为鲜重５ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ，ＮＴ培养基的组成为：ＮＴ＋（０．５～１．０）ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ＋（２～６）ｍｇ／ＬＮＡＡ＋（０．１～０．５）ｍｇ／ＬＫＴ，培养３０天可产生不定根，继续培养至４５天，有８５％的细胞团产生长度为０．５ｃｍ～３ｃｍ的不定根；步骤六，不定根的稳定性培养：继代时在超净工作台上，挑选步骤五诱导的不定根中，根长度为１ｃｍ～２ｃｍ、细胞团直径在２ｍｍ以下、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，进行继代培养，在步骤五相同培养基上连续培养５代以上，即可形成稳定的不定根培养体系；同时将筛选的生长旺盛、分散性好，富有光泽、乳白色带细胞团的不定根，继代保存在ＭＳ培养基中，３５天继代一次，ＭＳ培养基组成为０．５～１．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ、ＮＡＡ２～６ｍｇ／Ｌ，ＫＴ０．１～０．５ｍｇ／Ｌ，蔗糖３０～４０ｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．８；步骤七，...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张兴，李琰，冯俊涛，王智辉，王永宏，
申请(专利权)人：西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]