烟草发状根培养法生产烟碱制造技术

本发明专利技术涉及烟草发状根培养法生产烟碱。用发根农杆菌侵染烟草无菌苗的外植体，诱导该外植体长出发根；用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测根系中的Ｔ－ＤＮＡ，以确定发状根株系；培养具有Ｔ－ＤＮＡ的根系，用固定化连续培养法，在改良的ＭＳＯ培养基中培养该最优发状根系，最后从培养基和发状根中提取烟碱。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及烟草发状根培养法生产烟碱。在长期的进化过程中，为了占据一定的生态位，植物获得了通过次生代谢而产生各种次生代谢物质的能力。人类对植物次生代谢物质的利用有着悠久的历史，当今对植物次生物质利用的研究更是方兴未艾。但植物次生代谢物质的产量受植物产量和次生物含量的限制，有些次生物质在自然界的含量甚微，从而局限了植物次生物质的广泛应用。随着在生物技术方面取得的长足进步，人们把目光聚集在了如何利用生物技术以获得植物次生物质的研究上。利用生物技术获得植物次生物质有两种方法，一是植物细胞培养方法，二是发状根培养法。利用植物细胞培养技术生产次物代谢物真正实现商品化性业生产的还为数甚少，其主要原因在于培养的植物细胞生长缓慢，次生代谢物含量太低，以及生产能力不稳定，工业化生产时工艺复杂，操作繁锁，成本太高。由于发根具有培养时生长迅速且不需添加外源激素，拥有亲本植株的特征次级代谢途径，遗传的稳定性，起源于单个细胞，处于分化状态等特点，尤其是发状根的稳定性和生长迅速的特点是工业化生产梦寐以求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的，因此，人们对其进行了广泛的研究，并逐步将其应用到了生产植物次生代谢物质。至今已有不少植物被诱导并产生了发根，且次生代谢物的含量也大大提高。Youshikawa和Furuya通过人参愈伤组织诱导出发根，在无外源激素的条件下，其生长速度为用激素诱导根的2倍，人参皂甙(Rb和Rg)含量最高可达干重的0.95％，高于天然栽培根(0.4％)的含量。Shimomura等诱导紫草再生植株产生的发根在2L气升式反应器中生长迅速，通过与反应器连接的AmberliteXAD-2大孔树脂柱将分泌到培养基中的紫草色素回收，每天吸附5mg紫草色素，且可连续生产220天。Parr等通过诱导长春花形成发根，从发根中得到了悬浮细胞不能合成的长春碱。这些试验证明，亲本植株能合成的次生代谢物都可用发根培养物来生产，因而被认为是一条利用生物技术生产次生代谢物(如药物、天然色素、香料、天然调味品等)的新的有效途径。本专利技术的目的旨在利用发根培养技术，通过烟草的发状根培养法以生产烟碱。本专利技术制备了高含量烟碱的基因工程烟草发状根。首先获得无菌烟草实生苗；用发根农杆菌侵染该烟草无菌苗的外植体，诱导其长出发根；用Southern杂交的方法检测这些根中是否含有T-DNA，含有T-DNA的根即为发状根；将发状根进行扩大培养，发状根中合成的烟碱分泌到培养基中，从培养基中即可提取烟碱，提出的烟碱可用于生产农药、医药等多种用途。实施例1高含量烟碱的转基因烟草发状根的制备1.无菌实生苗的获取将烟草种子作消毒灭菌处理，点播于盛有固体MSO培养基的培养皿中，待发芽后转接于盛有固体MSO培养基的100ml三角瓶中，待苗长至3～5周即可作侵染用；2.侵染用A4农杆菌侵染上述烟草无菌苗的叶柄。侵染时用移液器向叶柄切口处点少量菌液，将侵染有菌液的外植体放在含有MSO固体培养基的培养皿上培养2天左右，即可长出发根。3.除菌在发根长至1cm左右时，加入500μg/1的头孢毒素或羧苄霉素以除菌。除菌后待根长长至2～3cm时将其从外植体上切离，转至含MSO固体培养基的培养皿中，在40℃下培养2天左右，以完成进一步除菌。4.继代将除菌后的单根在固体MSO培养基中培养，2～3周继代一次，使发根量不断扩增，直至发根的量达到鲜重100-200毫克以上时可用于鉴定。5.鉴定用Southern杂交的方法检测步骤4中得到的多个根系，确定出含有T-DNA的根系，即为发状根。6.扩大培养对步骤5得到的烟草发根株系在固体的MSO培养基中，28℃进行培养，反复继代，一般继代3-4次，每2周继代一次，得到稳定的该株系发根。实施例2发状根培养法生产烟碱将实施例1所得的发根接种到气升式反应器的改良的MSO液体培养基培养，使发根量不断增大，在28℃，无光照，培养1个月，发根增至接种量的8.5倍，发根所合成的烟碱分泌到液体培养基中，取出旧培养基，同时加入新培养基，采用常规方法从旧培养基中提取出烟碱。培养基中烟碱含量为0.33％，发根中烟碱含量为0.42％(湿基)，此过程可重复进行三次。本实施例使用的改良的MSO培养基配方(mg/L)MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KNO33984，KH2PO4170，FeSO4·7H2O 27.8，MnSO4·4H2O 22.3，KI 0.83，CoCl2·6H2O0.025，ZnSO4·7H2O 8.6，CuSO4·5H2O 0.025，H3BO36.2，Na2MoO4·2H2O 0.25。权利要求1.高含量烟碱的转基因烟草发状根的制备方法，其特征在于用发根农杆菌侵染转化烟草细胞和愈伤组织，得到转化了T-DNA的烟草发状根株系，再将该株系进行固定化连续培养。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于采用的发根农杆菌是A4农杆菌。3.如权利要求1所述的制备方法，该方法包括A.获取烟草无菌实生苗将烟草种子作消毒处理，点播于盛有固体MSO培养基的培养皿中，待发芽后转接于盛有固体MSO培养基的100ml三角瓶中，待苗长至3～5周即可作侵染用；B.侵染取下烟草无菌实生苗的叶柄，用移液器向叶柄切口处点上少量菌液，将侵染有菌液的烟草叶柄放在盛有MSO固体培养基的培养皿上培养，待其长出1cm左右长的发根；C.除菌待被侵染的叶柄长出1cm左右的根后，用头孢毒素或羧苄霉素除去农杆菌。继续培养，当根长至2～3cm时将其从叶柄上切离，转至固体MSO的培养基上，在40℃下培养2天，至完全除菌；D.继代将除菌的单根在固体MSO培养基中培养。2～3周继代一次，使其量不断扩增，得到一定量的系列根系；E.鉴定用Southern杂交的方法检测步骤D中得到的系列根系，确定出含有T-DNA的根系，此根系即为转基因的发状根。4.烟草发状根培养法生产烟碱的方法，其特征在于将权利要求1制备的发状根进行扩大培养，接种到液体培养基，从培养液和发状根中提取烟碱。5.如权利要求4所述的生产烟碱的方法，其特征在于所述的扩大培养是将发状根在MSO培养基中继续培养、继代2-3次。6.如权利要求4所述的生产烟碱的方法，其特征在于所述的液体在气升式反应器中进行，采用改良的液体MSO培养基，28℃，无光照，培养1个月。7.如权利要求6所述的生产烟碱的方法，其特征在于所述的改良的MSO培养基配方为(mg/L)MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KNO33984，KH2PO4170，FeSO4·7H2O 27.8，MnSO4·4H2O 22.3，KI 0.83， CoCl2·6H2O0.025，ZnSO4·7H2O 8.6，CuSO4·5H2O 0.025，H3BO36.2，Na2MoO4·2H2O 0.25。全文摘要本专利技术涉及烟草发状根培养法生产烟碱。用发根农杆菌侵染烟草无菌苗的外植体,诱导该外植体长出发根;用Southern杂交检测根系中的T－DNA,以确定发状根株系;培养具有T－DNA的根系,用固定化连续培养法,在改良的MSO培养基中培养该最优发状根系,最后从培养基和发状根中提取烟碱。文档编号A01H4/00GK1276422SQ00107949公开日2本文档来自技高网...

【技术保护点】
高含量烟碱的转基因烟草发状根的制备方法，其特征在于用发根农杆菌侵染转化烟草细胞和愈伤组织，得到转化了Ｔ－ＤＮＡ的烟草发状根株系，再将该株系进行固定化连续培养。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹阳，巩普遍，董建新，樊红梅，张兴，
申请(专利权)人：西北农林科技大学无公害农药研究服务中心，
类型：发明
国别省市：61[中国|陕西]