干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法技术

本文公开了用于各种不同应用例如细胞疗法的SC‑β细胞和分离的SC‑β细胞群体的产生方法。

Production methods of stem cell derived beta cells and their use

Disclosed herein are used in various applications such as cell therapy SC beta cells and isolated SC beta cell population generation method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法相关申请本申请要求2014年12月18日提交的美国临时申请系列号62/093,974的权益，其全部教导内容通过参考并入本文。
技术介绍
根据国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation)的报告，糖尿病在全世界影响超过3亿人口。1型糖尿病和2型糖尿病涉及β细胞破坏和/或β细胞功能障碍。糖尿病患者，特别是患有1型糖尿病的患者，有可能通过移植β细胞而治愈。尽管人类尸体胰岛移植可以为患者提供5年或更长时间的胰岛素不依赖性，但由于供体胰岛的不足和质量(Bellin等，2012)，这种方法受到限制。从干细胞产生无限制供应的人类β细胞可以为数百万患者提供疗法，因为可能只需要生产单一的细胞类型即β细胞，并且递送方式已被良好地了解：在免疫保护下移植到身体内的血管化位点。此外，由于有限的胰岛供应和由不同的死因、供体遗传学和它们分离中的其他情况造成的可变性，为了鉴定改善β细胞功能、存活或增殖的新药物而进行的筛选也被延迟。因此，干细胞来源的β细胞的稳定均一的供应将为糖尿病提供有用的药物发现平台。此外，遗传上多样化的干细胞来源的β细胞可用于体外或体内疾病建模。
技术实现思路
对于产生干细胞来源的β(SC-β)细胞的方法，存在着需求。本专利技术涉及致力于应对这种需求并具有其他所需特征的解决方案。根据本专利技术的实施方式，提供了一种用于产生干细胞来源的β(SC-β)细胞的方法。所述方法包括将细胞群体与引导向SC-β细胞分化的药剂在促进细胞簇集的条件下并与其他药剂相接触，所述其他药剂包含下述一者或多者：a)当所述细胞群体包含i)分化成PDX1+胰腺祖细胞的FOXA2+、SOX2+原始前肠细胞，ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞，和/或iii)分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的降低rho相关蛋白激酶(Rock)的水平和/或活性的药剂；b)当所述细胞群体包含分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞时，有效量的激活素A；以及c)当所述细胞群体包含分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的星孢菌素，由此产生SC-β细胞。根据本专利技术的某些方面，所述方法还包括在PDX1+胰腺祖细胞已分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞之后任选地洗涤所述细胞群体，以在将所述细胞群体与星孢菌素接触之前解除激活素A与所述细胞群体的接触。根据本专利技术的某些方面，所述药剂包含Y-27632。根据本专利技术的某些方面，所述药剂的有效量包含10μΜ的浓度。根据本专利技术的某些方面，激活素A的有效量包含5ng/ml的浓度。根据本专利技术的某些方面，星孢菌素的有效量包含3nM的浓度。根据本专利技术的某些方面，将包含分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞的细胞群体暴露于所述药剂和激活素A6天的时间段。根据本专利技术的某些方面，至少在75％至80％之间的所述细胞群体在分化成SC-β细胞之前分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞。根据本专利技术的某些方面，所述药剂i)阻止细胞簇解体或使细胞簇解体最小化，ii)促进细胞存活，iii)增加细胞簇尺寸，及其组合。根据本专利技术的实施方式，提供了一种分离的SC-β细胞或其群体，所述分离的SC-β细胞或其群体在体外和体内两种情况下表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)响应。根据本专利技术的某些方面，所述分离的SC-β细胞或其群体表现出至少在1.0至3.0之间的刺激指数。根据本专利技术的某些方面，所述分离的SC-β细胞或其群体在高葡萄糖浓度下每30分钟的温育产生大约300uIU至4000uIU。根据本专利技术的实施方式，提供了一种微胶囊，所述微胶囊包含包封在其中的所述分离的SC-β细胞或其群体。根据本专利技术的实施方式，提供了一种宏包封装置，所述宏包封装置包含包封在其中的所述分离的SC-β细胞或其群体。根据本专利技术的实施方式，提供了一种细胞系，其包含稳定地表达胰岛素的分离的SC-β细胞。根据本专利技术的实施方式，提供了一种测定法，所述测定法包含所述分离的SC-β细胞或其群体或所述细胞系。所述测定法可用于：i)鉴定一种或多种促进或抑制选自β细胞增殖、β细胞复制、β细胞死亡、β细胞功能、β细胞对免疫攻击的易感性和β细胞对去分化或分化的易感性的β细胞命运的候选药剂；或ii)鉴定一种或多种促进至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前体细胞分化成至少一种SC-β细胞的候选药剂。根据本专利技术的实施方式，公开了一种用于治疗有需要的对象的方法。所述方法包括向有需要的对象给药i)分离的SC-β细胞群体；ii)包含包封在其中的SC-β细胞的微胶囊；和/或iii)包含包封在其中的所述SC-β细胞的宏包封装置。根据本专利技术的实施方式，分离的SC-β细胞群体、包含所述分离的SC-β细胞群体的微胶囊和/或包含所述分离的SC-β细胞群体的宏包封装置被用于向有需要的对象给药。根据本专利技术的某些方面，所述对象患有糖尿病或具有发生糖尿病的提高的风险，或患有代谢障碍或具有发生代谢障碍的提高的风险。根据本专利技术的实施方式，提供了包含SC-β细胞的人造胰岛或胰腺。除非另有指明，否则本专利技术的实践通常使用本领域技术范围之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术。某些这些技术的非限制性描述存在于下述出版物中：Ausubel,F.等主编，《现代分子生物学方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，《现代免疫学方法》(CurrentProtocolsinImmunology)，《现代蛋白质科学方法》(CurrentProtocolsinProteinScience)和《现代细胞生物学方法》(CurrentProtocolsinCellBiology)，均由JohnWiley&Sons,N.Y.出版，2008年12月的版本；Sambrook,Russell和Sambrook，《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,2001；Harlow,E.和Lane,D.，《抗体实验指南》(Antibodies-ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1988；Freshney,R.I.，《动物细胞培养基本技术手册》(CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique)第5版，JohnWiley&Sons,Hoboken,J,2005。关于治疗性药剂和人类疾病的非限制性信息存在于Goodman和Gilman的《治疗剂的药理基础》(ThePharmacologicalBasisofTherapeutics)第11版，McGrawHill,2005；Katzung,B.主编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生干细胞来源的β(SC‑β)细胞的方法，所述方法包括将细胞群体与引导所述细胞群体向SC‑β细胞分化的药剂在促进细胞簇集的条件下并与其他药剂相接触，所述其他药剂包含下述一者或多者：a)当所述细胞群体包含i)分化成PDX1+胰腺祖细胞的FOXA2+、SOX2+原始前肠细胞，ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞，和/或iii)分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的降低rho相关蛋白激酶(Rock)的水平和/或活性的药剂；b)当所述细胞群体包含分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞时，有效量的激活素A；以及c)当所述细胞群体包含分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的星孢菌素，由此产生SC‑β细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.18 US 62/093,9741.一种用于产生干细胞来源的β(SC-β)细胞的方法，所述方法包括将细胞群体与引导所述细胞群体向SC-β细胞分化的药剂在促进细胞簇集的条件下并与其他药剂相接触，所述其他药剂包含下述一者或多者：a)当所述细胞群体包含i)分化成PDX1+胰腺祖细胞的FOXA2+、SOX2+原始前肠细胞，ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞，和/或iii)分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的降低rho相关蛋白激酶(Rock)的水平和/或活性的药剂；b)当所述细胞群体包含分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞时，有效量的激活素A；以及c)当所述细胞群体包含分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞的PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞时，有效量的星孢菌素，由此产生SC-β细胞。2.权利要求1的方法，其还包括在PDX1+胰腺祖细胞已分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞之后任选地洗涤所述细胞群体，以在将所述细胞群体与星孢菌素接触之前解除激活素A与所述细胞群体的接触。3.权利要求1或2的方法，其中所述药剂包含Y-27632。4.权利要求1至3任一项的方法，其中所述药剂的有效量包含10μΜ的浓度。5.权利要求1至4任一项的方法，其中激活素A的有效量包含5ng/ml的浓度。6.权利要求1至5任一项的方法，其中星孢菌素的有效量包含3nM的浓度。7.权利要求1至6任一项的方法，其中将包含ii)分化成PDX1+、NKX6.1+胰腺祖细胞的PDX1+胰腺祖细胞的细胞群体暴露于所述药剂和激活素A6天的时间段。8.权利要求1至8任一项的方法，其中至少在75％至80％之间的所述细胞群体在分化成SC-β细胞之前分化成嗜铬粒蛋白A、NKX6.1+内分泌祖细胞。9.权利要求1至9任一项的方法，其中所述药剂i)阻止细胞簇解体或使细胞簇解体最小化，ii)促进细胞存活，iii)增加细胞簇尺寸，及其组合。10.一种按照权利要求1至9...

【专利技术属性】
技术研发人员：马斯·居特勒，道格拉斯·A·梅尔顿，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，
类型：发明
国别省市：美国,US