雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法技术

本发明专利技术公开了雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，包括酶解、纯化分段、旋蒸冷冻，在雌乌贼缠卵腺匀浆液中加入复合酶进行酶解，以双频率超声波与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后将酶解液通过醋酸纤维微孔滤膜与超滤膜分别进行抽滤纯化与超滤分段，然后将分段后的雌乌贼缠卵腺高抗氧化活性多肽进行低温干燥冷藏。有益效果为：将酶解时间由5‑7小时降低至30‑40分钟，极大地提高了酶解效率，在保证酶解彻底性与精确性的同时大大地节省了时间成本与人工成本；本发明专利技术方法收集了四个分子段的雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽，实现了雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的全效、精细的利用，避免了浪费。

【技术实现步骤摘要】
雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法
本专利技术涉及海洋生物活性物质的制备领域，尤其是涉及雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法。技术背景乌贼，又称墨斗鱼或墨鱼，隶属软体动物门，头足纲，乌贼目，乌贼科，分布于世界各大洋，主要生活在热带和温带沿岸浅水中，冬季常迁至较深海域。我国常见并有广泛研究的乌贼有枪乌贼（俗称鱿鱼），金乌贼与无针乌贼等。乌贼鱼性质温和，味微咸，具有补益精气、健脾利水、养血滋阴、治疗高血压、温经通络、收敛止血、美肤等功效，而且，乌贼鱼肉质中含有一种可降低胆固醇的氨基酸，可防止动脉硬化；常吃乌贼鱼也可提高免疫力，防止骨质疏松，缓解倦怠乏力，对食欲不振等作用显著，包括ArefNeifar,Walidsaibi，等对乌贼墨中酶系的研究；CULKINF,MORISRJ对乌贼中的DHA、EPA两种脂肪酸的研究；除此之外，乌贼缠卵腺也有一定的研究价值，乌贼缠卵腺位于直肠两侧内脏囊壁，开口于外套腔，作用是在产卵的同时分泌腺液将卵粒缠绕起来粘结成串，使卵串附着在海底的海藻或其它物体上。乌贼缠卵腺干制品俗称“墨鱼蛋”主产于我国山东，宁波等地，营养丰富，是山珍海味中的下八珍之一，同时它不仅是烹饪原料中的佳品,在海洋药物研究领域也有重要价值，乌贼缠卵腺中富含K、ca、Mg、Fe、Zn等元素，并且氨基酸种类齐全，EAA(必需氨基酸）含量丰富，比例合理，在当今海洋药物发展中值得一提。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，本专利技术简单易行，提取时间较短，提取效率较高，而且酶解产物的纯度很高。本专利技术针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，包括：酶解、纯化、旋蒸冷冻，具体包括以下步骤：酶解：按照料液比1:2-4配制乌贼缠卵腺匀浆液，调节pH为2.5-3.5，温度为36-37℃，加入乌贼缠卵腺重量2.5-3.8%的复合酶，以双频率超声与微波辐射间隔辅助酶解，酶解30-45分钟，在170-180℃灭活10-15分钟；冷却后，调pH至中性，用低温高速离心机在转速11000-12000r/min、温度-4-0℃条件下离心15-25分钟，取上清液，放入培养皿中待用；双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助产生交替的机械效应、热效应和空化效应等作用可使底物蛋白分子化学键断裂，表面结构及结晶结构发生变化，促进底物与酶的作用，显著提高复合酶对雌乌贼缠卵腺的酶解效率；纯化分段：用直径为50-100mm、孔径为0.35-0.45mm的醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30KD、10KD、3KD的超滤膜，收集>30KD、10-30KD、3-10KD、<3KD的四个分子段的酶解液，分别收藏备用；通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了高活性抗氧化肽的浪费，实现了雌乌贼缠卵腺的高效率利用，还可以更加精确与方便地对不同分子段的高氧化活性肽进行清除自由基与还原力方面的测试；旋蒸冷冻：将不同分子段的酶解液进行旋转蒸发，除去多余水分，分装至培养皿中，放置于-80~-100℃冰箱冷冻；将冷冻24-36小时后的酶解物置于冷冻干燥机中，48-72小时后得到酶解粉末并进行分袋密封备用；将高抗氧化活性肽进行超低温冷冻并低温干燥后封存，有助于保持其抗氧化活性，同时也方便了对其进行保存与运输。作为优选，复合酶为重量比为3-5:1的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物；复合酶的协同作用可以将底物更加彻底的水解，提高水解效率，降低成本。作为优选，双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波45-60秒，关闭超声波，开启微波辐射10-15秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波45-60秒，关闭超声波，开启微波辐射10-15秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本。作为优选，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为23-25kHz、0.30-0.35W/cm2与63-65kHz、0.50-0.55W/cm2，微波辐射的功率为100-180W；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1）通过使用复合酶与双频率复合超声波、微波辐射的辅助，可以将酶解时间由5-7小时降低至30-40分钟，极大地提高了酶解效率，在保证酶解彻底性与精确性的同时大大地节省了时间成本与人工成本；2）本专利技术方法分别收集了>30KD、10-30KD、3-10KD、<3KD四个分子段的雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽，不仅方便了对雌乌贼缠卵腺酶解活性肽抗氧化性与还原力的精细化研究，还实现了雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的全效利用，避免了浪费。附图说明图1是本专利技术中不同分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的DPPH自由基清除率与VC对照清除率测定结果图；图2是本专利技术中<3KD分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽不同浓度的DPPH自由基清除率与VC对照清除率测定结果图；图3是本专利技术中不同分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的还原力测定结果图；图4是本专利技术中3-10KD分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽不同浓度的还原力测定结果图；图5是本专利技术中不同分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的羟自由基清除率与VC对照清除率测定结果图；图6是本专利技术中3-10KD分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽不同浓度的羟自由基清除率与VC对照清除率测定结果图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，具体包括以下步骤：乌贼缠卵腺酶解液制备：取较多量乌贼缠卵腺匀浆液，在料液比为1:3、酶解温度为37℃、蛋白酶添加量为2.4%乌贼缠卵腺重量、木瓜蛋白酶添加量为0.6%乌贼缠卵腺重量、pH为3.0、酶解时间为7h的条件下进行酶解，酶解后高温灭活、冷却、低温高速离心后备用；酶解液抽滤：用直径50mm，孔径0.45mm的醋酸纤维微孔滤膜，进行抽滤，除去酶解液中较粗颗粒；乌贼缠卵腺酶解液多肽分段：用超滤装置让酶解液依次通过30KD、10KD、3KD的超滤膜，分为>30KD、10-30KD、3-10KD、<3KD四个分子段，分别收藏备用。旋转蒸发：将不同分子段的酶解液进行旋转蒸发，除去多余水分，每个分子段装一到两个培养皿，放置于-80℃冰箱冷冻。冷冻干燥：将冷冻24h后的酶解物，置于冷本文档来自技高网...

【技术保护点】
雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，包括：酶解、纯化分段、旋蒸冷冻，其特征在于：所述的酶解步骤为：配制雌乌贼缠卵腺匀浆液，加入乌贼缠卵腺重量2.5‑3.8%的复合酶，以双频率超声与微波辐射间隔辅助酶解，酶解完成后以170‑180℃灭活10‑15分钟；冷却后，调pH至中性，用低温高速离心机在转速11000‑12000r/min、温度‑4‑0℃条件下离心15‑25分钟，取上清液，放入培养皿中待用。

【技术特征摘要】
1.雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，包括：酶解、纯化分段、旋蒸冷冻，其特征在于：所述的酶解步骤为：配制雌乌贼缠卵腺匀浆液，加入乌贼缠卵腺重量2.5-3.8%的复合酶，以双频率超声与微波辐射间隔辅助酶解，酶解完成后以170-180℃灭活10-15分钟；冷却后，调pH至中性，用低温高速离心机在转速11000-12000r/min、温度-4-0℃条件下离心15-25分钟，取上清液，放入培养皿中待用。2.根据权利要求1所述的雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的酶解步骤中的雌乌贼缠卵腺匀浆液的料液比为1:2-4，pH为2.5-3.5，温度为36-37℃，酶解时间为30-45分钟。3.根据权利要求1所述的雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的酶解步骤中的复合酶为重量比为3-5:1的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物。4.根据权利要求1所述的雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，其特征在于：所述的酶解步骤中的双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的操作步骤为：开启双频率超声波45-60秒，关闭超声波，开启微波辐射10-15秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波45-60秒，关闭超声波，开启微波辐射...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨最素，黄芳芳，薛玲娇，叶捷娜，张林佳，丁国芳，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33