利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，包括脱脂、第一次脱腥、酶解、第二次脱腥、超滤、脱色并脱盐和冷冻干燥。采用1‑乙基‑3‑（3‑甲基氨基）丙基碳二亚胺活化壳聚糖，并与戊二醛偶联形成脂肪酶固定化载体，再利用活性短肽来提高载体与脂肪酶之间的物理和化学吸附力，提高脂肪酶的稳定性、酶活性、耐热性和使用次数；利用嗜热菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解位点的互补作用和协同作用可提高深海鱼鱼糜蛋白的水解程度、酶解反应速度和改变端基的类型，水解出具有抗肿瘤活性的活性多肽。

【技术实现步骤摘要】
利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法
本专利技术涉及生物活性物质制备领域，具体是一种利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法。
技术介绍
目前局部癌症虽然可以成功地运用外科手术和放射疗法治疗，但化学疗法仍是常规治疗晚期或转移性肿瘤的首选。由于化疗药物存在选择性低、不良反应大、多药耐药等缺陷，很大程度上限制了其使用。天然存在的海洋活性多肽由于在生物体中含量低，而且提取困难，难以实现大量生产供给所需，化学人工合成多肽成本昂贵。海洋生物蛋白资源是21世纪人类重要的蛋白类食物及生物活性物质的重要来源。我国目前的海洋生物蛋白资源总量在世界各国名列前茅，但我国目前的蛋白类水产品中，除一部分直接食用外，大部分通过简单的加工技术制成食品进入市场，加工技术落后，产品结构单一，产品的附加值低，使得产品在国际市场上的竞争力较差。因此，我国急需对海洋生物蛋白资源进行优化利用和高值化加工。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，制备得到的活性多肽呈白色，无腥味，脂质含量非常低，分子量在1000~4000道尔顿，在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，包括脱脂、第一次脱腥、酶解、第二次脱腥、超滤、脱色并脱盐和冷冻干燥。得到的活性多肽与小分子化学药物相比，对目标肿瘤具有更高的亲和力和更强的特异性，并且不良反应低，还可以增加肿瘤对其他治疗方法的敏感度；与抗体相比，由于它们体积微小，因此更容易渗透到组织中，作为抗肿瘤化合物具有良好的前景。其中，第二次脱腥步骤为在酶解液中接种活化的酿酒酵母和双歧杆菌，于32~43℃下恒温发酵1.5~3.5h。酿酒酵母和双歧杆菌的加入量分别为0.5~1.0‰和0.8~1.8‰，分别购买于安琪酵母股份有限公司和山东向日葵生物科技有限公司。酿酒酵母和双歧杆菌在发酵过程中存在明显的协同作用，将二甲基甲胺、十二甲基六氧硅烷和十二甲基五氧硅烷等腥味物质作为氮源或氮源被分解，大幅降低酶解液的腥味。同时，发酵产物乙醇也具有脱腥的作用，可降低腥味。脱脂步骤为：深海鱼鱼肉切成小块，加入2~4‰壳聚糖固定化脂肪酶，加入8~15倍体积的蒸馏水，于25~50℃下恒温酶解0.8~2.5h，酶解结束后灭酶，过滤得到脱脂深海鱼鱼肉。脂肪酶可将深海鱼鱼肉中的脂肪逐步水解成甘油和脂肪酸。固定化后的脂肪酶，其稳定性、酶活性、耐热性均有明显提高，并可重复使用。壳聚糖固定化脂肪酶的制备步骤为：用干燥壳聚糖粉末，用pH6.0~6.8的60~80mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜，然后加入壳聚糖粉末质量0.7~1.2％的1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化0.5~0.9h，再加入壳聚糖粉末1~2倍体积的戊二醛偶联反应1~1.8h，用蒸馏水清洗5~8次，加入0.7~2.0mg/mL脂肪酶溶液和0.1~0.3‰活性短肽，于冰浴中缓慢搅拌0.5~1.5h，然后放置冰箱中过夜，次日用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化脂肪酶。1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺对壳聚糖进行化学改性，有效活化了壳聚糖表面羟基基团。活化后的壳聚糖表面氨基与戊二醛偶联得到优良的脂肪酶固定化载体。脂肪酶吸附在载体上形成壳聚糖固定化脂肪酶。活性短肽的氨基酸序列为SCASVCKARCLRARGCRCVSVYCRCLR。上述活性短肽可明显增强脂肪酶和脂肪酶固定化载体之间的物理和化学吸附作用力，提高固定化脂肪酶转化率，并且提高壳聚糖固定化脂肪酶可重复使用次数。第一次脱腥步骤为：将脱脂深海鱼鱼肉浸于脱腥液中0.4~0.8h，浸泡温度为0~4℃，脱腥液成分及其重量份为茶多酚3~8份、纯水10~20份和葡萄籽提取物0.2~0.8份。上述脱腥液中成分协同作用，具有多种生物学活性，可以消除甲基硫醇化合物，并可以与氨基酸结合，具有一定的钝化酶类和杀菌作用，且成分天然，绿色安全。酶解步骤为：将第一次脱腥后的鱼肉打浆成鱼糜，加入2~4倍体积的蒸馏水，加入0.1~0.3%的嗜热菌蛋白酶和0.2~0.5%胰凝乳蛋白酶，于27~40℃，自然pH值下酶解1.5~3.0h，灭酶后加入4~8‰风味蛋白酶，于45~55℃，pH6.0~6.8条件下酶解0.5~1.0h，过滤取滤液。利用嗜热菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解位点的互补作用和协同作用可提高深海鱼鱼糜蛋白的水解程度、酶解反应速度和改变端基的类型，水解出具有抗肿瘤活性的活性多肽。风味蛋白酶是肽链外切酶，可水解肽链两端氨基酸所形成的肽键（苦味肽），将苦肽彻底降解为氨基酸。同时，酶解产物和氨基酸一起与风味酶中的还原糖发生美拉德反应，产生天然香味，因此酶解液具有独特的风味并显著减少水解造成的苦味。超滤步骤为先采用截留相对分子质量30~40kD的膜超滤，再采用截留相对分子质量4~8kD的膜超滤。为了防止膜孔堵塞或膜损害，先采用大孔超滤膜进行超滤，再采用小孔超滤膜超滤，有效去除分子量大于4~8kD的杂质。脱色并脱盐步骤为：在超滤液中加入0.5~1.5%活性炭，在60~70℃，转速100~200r/min条件下脱色0.4~0.8h，过滤取滤液，最后将滤液进行纳滤除盐。活性炭具有致密的孔状结构，对色素和腥味物质具有优良的吸附性，使最后得到的活性多肽冻干粉呈白色，无腥味。500道尔顿以下的部分由寡肽和氨基酸组成，这部分组分的生物活性较差，且大部分是苦味肽。纳滤可有效除去500道尔顿以下的杂质和溶液中的无机盐，对活性多肽进一步进行纯化。冷冻干燥步骤为在纳滤除盐后的酶解液中加入20~35wt%聚乙烯吡洛烷酮，冷冻干燥得到活性多肽冻干粉。活性多肽结合抗原作用于机体的免疫系统，激活免疫细胞，促使其分化成熟，提高免疫细胞的活性和数量，增强自身抗肿瘤的能力。上述活性多肽在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。活性多肽能够抑制HL-60增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与促使p53蛋白表达上调、Bcl-2表达下调有关，但具体机制并不明确。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1.采用1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化壳聚糖，并与戊二醛偶联形成脂肪酶固定化载体，再利用氨基酸序列为SCASVCKARCLRARGCRCVSVYCRCLR的活性短肽来提高载体与脂肪酶之间的物理和化学吸附力，提高脂肪酶的稳定性、酶活性、耐热性和使用次数；2.利用嗜热菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解位点的互补作用和协同作用可提高深海鱼鱼糜蛋白的水解程度、酶解反应速度和改变端基的类型，水解出具有抗肿瘤活性的活性多肽。风味蛋白酶是肽链外切酶，可水解肽链两端氨基酸所形成的肽键（苦味肽），将苦肽彻底降解为氨基酸。同时，酶解产物和氨基酸一起与风味酶中的还原糖发生美拉德反应，产生天然香味，因此酶解液具有独特的风味并显著减少水解造成的苦味；3.得到的活性多肽结合抗原作用于机体的免疫系统，激活免疫细胞，促使其分化成熟，提高免疫细胞的活性和数量，增强自身抗肿瘤的能力。活性多肽在增强体内非特异性免疫的同时存在抗肿瘤的特异性T淋巴细胞免疫应答。活性多肽能够抑制HL-60增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与促使p53蛋白表达上调、Bcl-2表达下调有关，但具体机制并不明确；4.本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，包括脱脂、第一次脱腥、酶解、第二次脱腥、超滤、脱色并脱盐和冷冻干燥，其特征在于：所述的第二次脱腥步骤为在酶解液中接种活化的酿酒酵母和双歧杆菌，于32~43℃下恒温发酵1.5~3.5h。

【技术特征摘要】
1.利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，包括脱脂、第一次脱腥、酶解、第二次脱腥、超滤、脱色并脱盐和冷冻干燥，其特征在于：所述的第二次脱腥步骤为在酶解液中接种活化的酿酒酵母和双歧杆菌，于32~43℃下恒温发酵1.5~3.5h。2.根据权利要求1所述的利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，其特征在于：所述的脱脂步骤为：深海鱼鱼肉切成小块，加入2~4‰壳聚糖固定化脂肪酶，加入8~15倍体积的蒸馏水，于25~50℃下恒温酶解0.8~2.5h，酶解结束后灭酶，过滤得到脱脂深海鱼鱼肉。3.根据权利要求2所述的利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，其特征在于：所述的壳聚糖固定化脂肪酶的制备步骤为：取壳聚糖粉末，用pH6.0~6.8的60~80mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡过夜，然后加入壳聚糖粉末质量0.7~1.2％的1-乙基-3-（3-甲基氨基）丙基碳二亚胺活化0.5~0.9h，再加入壳聚糖粉末1~2倍体积的戊二醛偶联反应1~1.8h，用蒸馏水清洗5~8次，加入0.7~2.0mg/mL脂肪酶溶液和0.1~0.3‰活性短肽，于冰浴中缓慢搅拌0.5~1.5h，然后放置冰箱中过夜，次日用蒸馏水彻底冲洗，过滤干燥得到壳聚糖固定化脂肪酶。4.根据权利要求3所述的利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，其特征在于：所述的活性短肽的氨基酸序列为SCASVCKARCLRARGCRCVSVYCRCLR。5.根据权利要求1所述的利用深海鱼鱼肉制备活性多肽的方法，其特征在于：所述的第一次脱腥步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：李健，
申请(专利权)人：兰溪市哥特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33