加热联合模拟消化制备胶原蛋白抗氧化多肽液的方法技术

本发明专利技术公开了加热联合模拟消化制备胶原蛋白抗氧化多肽液的方法，属于食品加工技术和蛋白利用技术领域。采用的制备工艺以酶溶性胶原蛋白为原料，高温预处理胶原蛋白，使用体外模拟胃肠消化技术，由含模拟胃蠕动频率和振幅、分泌腺分泌胃消化液的仿生动态鼠胃消化系统，以及之后的模拟肠消化，利用胃蛋白酶‑胰蛋白酶，两步酶解法。极大地提高了蛋白的酶解率，提高原料利用率。本发明专利技术使用动态模型模拟胃肠消化过程，在37℃环境下，更接近于人体模拟消化环境，过程更高效，相比人工合成抗氧化肽法、发酵法更安全可靠。

【技术实现步骤摘要】
加热联合模拟消化制备胶原蛋白抗氧化多肽液的方法
本专利技术属于食品加工技术和蛋白利用
，具体涉及利用加热预处理结合仿生动态鼠胃消化系统和模拟肠消化制备抗氧化多肽液。技术背景胶原蛋白(collagen)也称胶原，是一种广泛存在于脊椎类动物结缔组织中的非水溶性纤维状含糖蛋白质。胶原蛋白是生物高分子，含有少量的半乳糖和葡萄糖的蛋白质。其纯品呈白色，是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，组成细胞外基质(ECM)的框架结构。胶原蛋白直接摄入人体并不是十分容易消化吸收，因此在食品加工领域经常使用胶原蛋白的高温变性产物明胶来作为糖果添加剂、冰激凌稳定剂等，而胶原蛋白酶解产生的抗氧化肽更是在保健食品行业、美容行业等有着大量的使用。抗氧化肽是一类具有生物活性的肽，是蛋白质水解的中间产物。抗氧化多肽主要包括天然形成的抗氧化多肽，如谷胱甘肽等；蛋白降解产生的抗氧化多肽，如酶解大豆蛋白的酶解产物；人工合成的抗氧化多肽，等。其中酶解形成的抗氧化多肽符合人体的营养需求，易于工业化生产，且操作简单，高效。目前酶解蛋白产生多肽的多采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶等单一酶解方法。例如：中国专利CN106317170A中，以天然紫苏籽为原料，利用碱性蛋白酶提取酸沉淀法，经过纯化得到抗氧化肽。结果容易导致酶解不完全，形成的多肽分子量分布较复杂，因此带来分离纯化繁琐，成本较高等问题。胃肠是人体消化食物的主要场所，胃通过蠕动把食物和胃分泌液混匀，使食物颗粒研磨变小，并且在胃中发生部分生物化学反应，之后进入肠在肠消化液的作用下大部分都消化掉从而使食物更有利于人体消化吸收。因此本专利技术先采用加热预处理技术，再通过仿生动态鼠胃消化系统来进行模拟胃消化，之后加入模拟肠消化来制备抗氧化多肽液。
技术实现思路
本专利技术以加热预处理的酶溶性胶原蛋白为原料，利用仿生动态鼠胃消化系统来进行模拟胃消化，之后加入模拟肠消化来制备抗氧化多肽液。加热预处理的胶原蛋白仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，按照以下步骤进行：(1)酶溶性胶原蛋白用蒸馏水溶解成0.02g/mL的溶液，震荡使其溶解完全，高温水浴预处理，获得原料，以下简称PSCH。(2)构建仿生动态鼠胃消化系统：模拟胃液配制，称取10.42g胃蛋白酶，0.02g碳酸氢钠，0.44g氯化钠，0.08g胃粘膜素(mucin)，搅拌溶解在蒸馏水中，50mL容量瓶定容，用1MHCl调整pH为1.63±0.01。实验中，注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4mL，流量0.85mL/h，灌注时间为4h。消化系统装置37℃预热10min后，装样前鼠胃模型里面先加入0.6mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入样品进行模拟胃消化。(3)模拟肠消化系统：模拟肠消化液(模拟肠消化液的配制,称取0.68g磷酸二氢钾，用1M氢氧化钠调节pH为6.8，用蒸馏水定容到100mL，加入1g胰蛋白酶。)使用前37℃加热10min。胃消化阶段结束后加入4mL模拟肠消化液，在水浴37℃下持续搅拌消化6h。(4)上述消化液在100℃灭酶10min，5000×g离心10min除去大分子蛋白，所得上清液即为抗氧化肽液。其中步骤(1)中称取0.04g酶溶性胶原蛋白(实验室提取得)，用2mL蒸馏水溶解，溶液在100℃水浴锅中加热10min，以下简称PSCH。其中步骤(4)中使用高温灭酶，离心以除去大分子蛋白和不溶解的杂质，得到抗氧化肽液。本专利技术的优势在于：(1)本专利技术采用加热预处理胶原蛋白，可以使胶原蛋白更容易被消化吸收。(2)本专利技术采用仿生动态鼠胃消化系统装置来进行模拟胃消化，过程中模拟鼠胃的蠕动，每一分钟三个压缩循环，并且固定胃的压缩振幅，使消化更加彻底。(3)本专利技术采用仿生动态鼠胃消化系统装置来进行模拟胃消化，过程中在注射泵的作用下模拟分泌腺以一定分泌速度加入模拟胃液，胃消化结束后引入肠消化过程，两步酶解法，使得酶解液中的蛋白更少。(4)本专利技术模拟动物的消化系统，过程为动态模型消化，在食品安全方面，比其他的抗氧化多肽的生产，如发酵法和人工合成法所得到的产品更加安全合理。附图说明图1是抗氧化肽液的制备流程图。图2是标准分子量蛋白和多肽对照品色谱图(A)；仿生动态鼠胃消化系统消化后酶解液的相对分子质量分布图(B)。图3加热处理胶原蛋白样品总氨基酸测试色谱图。图4是仿生动态鼠胃模拟消化系统实物安装图，其中(1)马达；(2)频率控制；(3)轴；(4)角板；(5)弹簧；(6)压板；(7)体外仿生鼠胃；(8)支撑板。图5是模拟鼠胃示意图。具体实施方式仿生动态鼠胃消化系统装置(图4)由实验室购买所得，结构为由一个软硅胶制成的鼠胃模型、保温盒、体外电动压缩装置和模拟胃液分泌装置四部分组成。模拟鼠胃(图5)的制作是在小鼠体内取出胃，将其内部翻到外面，然后用特定的石蜡浇筑模型，修复后切开并流出分泌胃液和排空食物的管口，之后用硅胶制作鼠胃模型。模拟鼠胃的尺寸为40×30×21mm，内部的最大储水体积为9mL，较薄的前胃厚度为0.65±0.11mm，腺胃厚度为1.22±0.15mm。十二指肠和食道于胃的连接处的咽和幽门装上单向阀，咽的单向阀使气体可以进入以确保消化过程胃中的气压是恒定的，幽门处的单向阀只能排空消化物，阻止其回流入胃中。体外电动压缩装置由马达调节为接近真实鼠胃蠕动收缩频率即每分钟3个循环。通过调节角板的角度(弹簧的支点位置)和压缩板的螺丝位置，可以改变压缩板的初始位置和垂直移动高度即振幅，为保证固体颗粒有效破碎，振幅应设在4mm。本专利技术对加热预处理的胶原蛋白进行仿生动态鼠胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽，并用过程中游离氨基的含量变化来监测抗氧化肽的形成进程，利用高效液相色谱法测定仿生动态鼠胃结束后消化液的相对分子量分布。实施流程如图1所示。(1)可溶性氨基含量测定消化过程中每0.5h取适量的消化液，100℃水浴10min进行灭酶处理，5000×g离心10min除去大分子蛋白。取125μL消化液离心上清液与磷酸缓冲液(pH8.2)和2,4,6-三硝基苯磺酸溶液震荡混合均匀，50℃水浴避光反应30min，用亚硫酸钠溶液终止反应，室温下放置15min后，可见光分光光度计法在420nm波长下测定吸光值，相同试验方法用L-亮氨酸测定自由氨基含量，以此绘制标准曲线(y＝14.429x+0.0062，相关系数R2＝0.9925)，空白组用蒸馏水代替酶解液测定。(2)多肽分子量分布安捷伦1260色谱仪，色谱柱：TSKgel-G2000SWXL(300mm×7.8mm，Tosoh)；流动相：超纯水配制0.1mol/LNa2SO4+0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.7)混合均匀，超声脱气；试验柱温30℃；紫外检测器波长：220nm；检测流速：0.5mL/min；样品用流动相稀释合适倍数0.22μL水膜过滤才能上样，进样量为10μL。(3)总氨基酸测定称取1mL加热预处理好的胶原蛋白溶液于安瓿瓶中，加入5mL6mol/LHCl，震荡混匀。酒精喷灯封口，110℃油浴水解24h。漏斗过滤水解液(去离子水反复冲洗瓶内残余物质)，澄清液于50mL容量瓶中定容。取1mL定容后的样品液于1.5mL的离心管中，60℃离心浓缩再用去离子水重复蒸干，然后加1mL氨基酸分析用稀释液，振荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
加热预处理胶原蛋白的仿生动态模拟胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于按照以下步骤进行：（1）酶溶性胶原蛋白用蒸馏水溶解，高温水浴处理，获得原料；（2）构建仿生动态鼠胃消化系统：试验中注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4 mL，流量0.85 mL/h，灌注时间为4 h；消化系统装置37℃预热10 min后，装样前鼠胃模型里面先加入0.6 mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入2 mL样品进行模拟胃消化；（3）模拟肠消化系统：模拟肠消化液使用前37℃加热10 min；胃消化阶段结束后加入4 mL模拟肠消化液，在水浴37℃下持续搅拌消化6 h；（4）上述消化液在100℃灭酶10min，5000×g离心10 min除去大分子蛋白，所得上清液即为抗氧化肽液。

【技术特征摘要】
1.加热预处理胶原蛋白的仿生动态模拟胃消化和模拟肠消化制备抗氧化肽的方法，其特征在于按照以下步骤进行：（1）酶溶性胶原蛋白用蒸馏水溶解，高温水浴处理，获得原料；（2）构建仿生动态鼠胃消化系统：试验中注射泵选择工作模式为灌注，灌注量为3.4mL，流量0.85mL/h，灌注时间为4h；消化系统装置37℃预热10min后，装样前鼠胃模型里面先加入0.6mL模拟胃液来模拟鼠胃胃液残留，然后加入2mL样品进行模拟胃消化；（3）模拟肠消化系统：模拟肠消化液使用前37℃加热10min；胃消化阶段结束后加入4mL模拟肠消化液，在水浴37℃下持续搅拌消化6h；（4）上述消化液在100℃灭酶10min，5000×g离心10min除去大分子蛋白，所得上清液即为抗氧化肽液。2.根据权利要求1所描述的加热预处理胶原蛋白的仿生动态鼠胃和模拟肠消化制备抗氧化肽液的方法，其特征在于步骤（1）称取0.04g酶溶性胶原蛋白（实验室提取得），...

【专利技术属性】
技术研发人员：周存山，马海乐，李妍花，张磊，余筱洁，任晓锋，冯亚斌，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32