一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法技术

本发明专利技术涉及胶原蛋白的纯化技术领域，具体涉及一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法。该工业化方法包括：步骤一，制备胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液；步骤二，调节胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液的pH值至胶原蛋白的等电点，待胶原蛋白沉淀析出后，过滤，弃去母液，得到白色沉淀物即为胶原蛋白；步骤三，用水对胶原蛋白进行洗涤，过滤。该去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，能快速清除蛋白酶，解决了胶原蛋白提取工艺中清除蛋白酶的困难，成功避免了胶原蛋白通过盐析而引入杂离子或者通过加热使蛋白酶变性失活而增大胶原蛋白结构破坏的可能性，该工业化方法具有操作简单易行，成本低，并能够适用于工业化大规模应用的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法
本专利技术涉及胶原蛋白的纯化
，具体涉及一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法。
技术介绍
胶原蛋白属于生物高分子物质，常见胶原蛋白类型为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型，其在临床、美容与保健方面应用广泛，如临床上广泛使用的止血纤维、水凝胶、手术缝合线、敷料、止血海绵、人工血管、角膜、人工皮肤；胶原蛋白也适用于轻中度炎症痤疮、痤疮愈后早期色素沉着、痤疮愈合后早期表浅性疤痕的治疗；对治疗皮肤过敏，减轻激光、光子治疗术后疤痕的形成有辅助疗效；在创面愈合期有减轻色素沉着和促进创面愈合的作用。对于胶原蛋白的提取，一般使用酸法、碱法、盐法、酶法提取胶原蛋白，单独使用酸法处理时，反应强烈，水解彻底，而且使用酸提取时，根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同，可以得到分子量不均的胶原水解物。中等浓度酸在彻底水解过程中，其色氨酸全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，且设备腐蚀严重。由于各种不足，酸法很少单独使用，一般和酶法配合。单独使用碱法处理易引起蛋白质变性，所得产物等电点pH值较低，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏，甚至产生D、L-型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高过L型氨基酸，则会抑制L-型氨基酸的吸收，部分D型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突变的作用。单独使用盐法处理时，盐的浓度达到一定量时，胶原蛋白就会溶解在其中，但胶原的溶解和分级受中性盐效应影响，有的盐可提高胶原的稳定性，而有的则可降低其构象稳定性，从而对提取天然胶原蛋白很不利。单独使用酶法处理时：影响酶提取的因素有很多，如酶浓度、酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、pH值以及料液比等。以上的提取方法均有一定的提取率，但是通常在实际操作中，大多数采用酸酶复合法提取胶原蛋白，较多的是使用胃蛋白酶提取，有机酸多为乙酸。酸酶复合法提取胶原蛋白，不仅能破坏分子间盐键和希夫碱，引起纤维膨胀、溶解，将没有交联的胶原分子溶解出来，以及溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维释放到溶剂中，还可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率而不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，减少了胶原蛋白的免疫原性。但蛋白酶会刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，是过敏源的一种，需要除去。蛋白酶与胶原蛋白长期作用，会导致胶原蛋白裂解为胶原蛋白肽甚至小分子量的氨基酸；为消除蛋白酶对胶原蛋白分子结构的影响，现有技术通常通过加热的方法使蛋白酶变性失活，加热操作步骤加大了胶原蛋白变性的风险性，进而破坏了胶原蛋白的功效。胶原蛋白的提取与纯化工艺已有较多文献进行了报导，但与蛋白酶结合提取法中如何去除蛋白酶的研究未见相关资料报导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，该工业化方法能够快速去除蛋白酶外源性物质。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：提供一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，它包括以下步骤：步骤一、将处理好的含有胶原蛋白的物质用溶剂和蛋白酶进行提取，在此期间监测胶原蛋白含量的变化情况，并经高速离心方法去除不溶性杂质，得到胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液；步骤二、用第二溶剂调节步骤一制得的胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液的pH值至胶原蛋白的等电点，然后静置，待胶原蛋白沉淀析出后，再进行过滤，然后弃去母液，得到白色沉淀物即为胶原蛋白；步骤三、用水对胶原蛋白进行洗涤，然后过滤，由于蛋白酶大量分布在水中，经过若干次洗涤，即能基本除尽蛋白酶。上述技术方案中，所述步骤一中，所述含有胶原蛋白的物质来源于牛跟腱、猪跟腱、羊跟腱、鱼鳔、猪皮、海参体壁、鳕鱼皮或水母伞盖的一种或任意两种以上的组合物；或者，所述含有胶原蛋白的物质来源于畜禽源动物的组织或水生生物的组织的提取物；或者，所述含有胶原蛋白的物质为经过发酵或人工重组方法而获得的胶原蛋白；所述畜禽源动物的组织包括牛跟腱、猪跟腱、羊跟腱、羊软骨、猪皮、鹿皮或驴皮中的一种或任意两种以上的组合物；所述水生生物的组织包括海水鱼(如鳕鱼、大马哈鱼、狮子鱼等)、淡水鱼(罗非鱼、鲶鱼、鲤、鲢、草、鳙等)、棘皮生物(多棘海盘鱼、海星、海参、海胆等)、鱿鱼、乌贼等的皮肤、鱼鳞、鱼鳔一种或任意两种以上的组合物。上述技术方案中，所述步骤一中，所述溶剂为酸、盐类中的一种或酸与酸、盐与盐任意两种以上的组合物；所述水为纯化水，包括单蒸水、双蒸水、去离子水、超纯水；所述酸为盐酸、磷酸、甲酸、乙酸、酒石酸、苹果酸或柠檬酸；所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、石灰或碳酸钠；所述盐类为盐酸-三羟甲基胺基甲烷、氯化钠、柠檬酸盐或氨基甲脒盐酸盐。上述技术方案中，所述步骤一中，所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶[1]、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或胰凝乳蛋白酶[2]的一种或任意两种以上的组合物。上述技术方案中，所述步骤一中，所述含有胶原蛋白的物质与所述溶剂之间的重量比为1:8～500。上述技术方案中，所述步骤一中，所述蛋白酶占所述含有胶原蛋白的物质的重量百分比比为0.1％～15％。上述技术方案中，所述步骤一中，所述高速离心方法中的离心速度为5000rpm～20000rpm；所述不溶性杂质为未完全酶解的含有胶原蛋白的物质的粉末。上述技术方案中，所述步骤二中，所述第二溶剂为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾或碳酸氢钾、石灰的一种或任意两种以上的组合物。上述技术方案中，所述步骤二中，所述胶原蛋白的等点电pH为5～7。上述技术方案中，所述步骤二和步骤三中，所述过滤为采用筛网过滤，或者采用筛网结合离心进行过滤。本专利技术与现有技术相比较，有益效果在于：(1)本专利技术提供的一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，由于在提取胶原蛋白的过程中对胶原蛋白的pH进行调节后，能快速降低蛋白酶的活性，然后直接用纯水清洗即能完全除去蛋白酶，且其胶原蛋白三股螺旋结构不被破坏，并且胶原蛋白纯度高。(2)本专利技术提供的一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，能快速清除蛋白酶，解决了胶原蛋白提取工艺中清除蛋白酶的困难，成功避免了胶原蛋白通过盐析而引入杂离子或者通过加热使蛋白酶变性失活而增大胶原蛋白结构破坏的可能性，该工业化方法具有操作简单易行，成本低，并能够适用于工业化大规模应用的特点。附图说明图1是I型胶原蛋白用乙酸和胃蛋白酶提取期间的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中，通过不同时间段，取一小部分离心8000r/min，5分钟，取上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳来确定I型胶原蛋白是否被提取出来，有无变性的情况。图2是I型胶原蛋白用乙酸和胃蛋白酶提取期间的用紫外-可见分光光度计扫描的图谱，其中，取一小部分离心8000r/min，5分钟，监测I型胶原蛋白是否达到最佳的吸光度。图3是I型胶原蛋白用乙酸和胃蛋白酶提取期间的用紫外-可见分光光度计扫描的图谱，其中，取一小部分离心8000r/min，5分钟，取1ml上清液与4ml双缩脲反应半小时后监测I型胶原蛋白是否达到最佳的浓度(根据前期的标准曲线Y＝0.0482X+0.0007，X是浓度mg/ml,Y是吸光度)。图4是I型胶原蛋白用乙酸和胃蛋白酶提取期间的不同时间段取出一小部分用粘度计测量其粘度的变化情况图。图5是在I型胶原蛋白溶液中加入氢氧化钠调节pH到6.0～7.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一、将处理好的含有胶原蛋白的物质用溶剂和蛋白酶进行提取，在此期间监测胶原蛋白含量的变化情况，并经高速离心方法去除不溶性杂质，得到胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液；步骤二、用第二溶剂调节步骤一制得的胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液的pH值至胶原蛋白的等电点，然后静置，待胶原蛋白沉淀析出后，再进行过滤，然后弃去母液，得到白色沉淀物即为胶原蛋白；步骤三、用水对胶原蛋白进行洗涤，然后过滤，由于蛋白酶大量分布在水中，经过若干次洗涤，即能基本除尽蛋白酶。

【技术特征摘要】
1.一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，其特征在于：它包括以下步骤：步骤一、将处理好的含有胶原蛋白的物质用溶剂和蛋白酶进行提取，在此期间监测胶原蛋白含量的变化情况，并经高速离心方法去除不溶性杂质，得到胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液；步骤二、用第二溶剂调节步骤一制得的胶原蛋白和蛋白酶的混合溶液的pH值至胶原蛋白的等电点，然后静置，待胶原蛋白沉淀析出后，再进行过滤，然后弃去母液，得到白色沉淀物即为胶原蛋白；步骤三、用水对胶原蛋白进行洗涤，然后过滤，由于蛋白酶大量分布在水中，经过若干次洗涤，即能基本除尽蛋白酶。2.根据权利要求1所述的一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，其特征在于：所述步骤一中，所述含有胶原蛋白的物质来源于牛跟腱、猪跟腱、羊跟腱、鱼鳔、猪皮、海参体壁、鳕鱼皮或水母伞盖的一种或任意两种以上的组合物；或者，所述含有胶原蛋白的物质来源于畜禽源动物的组织或水生生物的组织的提取物；或者，所述含有胶原蛋白的物质为经过发酵或人工重组方法而获得的胶原蛋白；所述畜禽源动物的组织包括牛跟腱、猪跟腱、羊跟腱、羊软骨、猪皮、鹿皮或驴皮中的一种或任意两种以上的组合物；所述水生生物的组织包括海水鱼(如鳕鱼、大马哈鱼、狮子鱼等)、淡水鱼(罗非鱼、鲶鱼、鲤、鲢、草、鳙等)、棘皮生物(多棘海盘鱼、海星、海参、海胆等)、鱿鱼等的皮肤、鱼鳞、鱼鳔一种或任意两种以上的组合物。3.根据权利要求1所述的一种去除胶原蛋白提取过程中蛋白酶的工业化方法，其特征在于：所述步骤一中，所述溶剂为酸或盐类中的一种或酸与酸、盐与盐任意两种以上的组合物；所述水为纯化水，包括单蒸水、...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭新生，周艳芳，周艳星，刘雯恩，崔碧玲，范志强，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44