LAMP检测用引物组合及其反应体系制造技术

本发明专利技术公开了LAMP检测用引物组合及其反应体系，包括HPV16的LAMP检测用引物组、18亚型人乳头瘤病毒检测用引物组。本发明专利技术具有以下优点和效果：检测时进行环介导等温扩增反应过程中，从反应溶液中的绿色荧光出现，即可通过肉眼观察判定结果，鉴定结果更为直观清晰，采用本发明专利技术中的基因诊断方法检测仅需30分钟，与PCR技术进行比较，灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术，达到了检测时间短、鉴定结果直观清晰、灵敏度高、特异性强的效果。

Primer combination and reaction system for LAMP detection

The invention discloses a primer combination for LAMP detection and its reaction system, including primer group for HPV16 LAMP detection and primer group for detection of 18 subtype human papillomavirus. The invention has the following advantages: the detection of loop mediated isothermal amplification reaction process, emerged from the green fluorescence in the reaction solution, results can be observed by the naked eye, the identification results are more intuitive and clear, the gene diagnosis method of the present invention is detected only 30 minutes, compared with PCR technology, sensitivity the specificity and detection range of the method were equivalent to or better than PCR, and does not depend on any special equipment can realize the rapid on-site detection of high throughput, and the detection cost is far lower than the fluorescence quantitative PCR technology, achieves the detection time, the identification results of visibility, high sensitivity and specificity effect.

【技术实现步骤摘要】
LAMP检测用引物组合及其反应体系
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种LAMP检测用引物组合及其反应体系。
技术介绍
人乳头瘤病毒(HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区。早期转录区(E区)主要控制病毒的复制和转化功能；晚期转录区(L区)编码病毒的衣壳蛋白；长控制区(LCR区)包含复制起始区和复制转录控制元件。20世纪80年代，德国病毒学家HaraldzurHausen教授首次提出HPV病毒与宫颈癌发病相关的假说之后，经过20多年的科学研究，国际癌症研究所在1995年正式确认，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。依照WHO国际癌症研究机构(IARC)的研究成果，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。而高危型HPV中又以16、18型最常见，其中超过2/3的宫颈癌与其感染相关；HPV分型还与宫颈癌病理类型有关，16型与宫颈鳞癌关系最密切，18型最易导致宫颈腺癌。因此，检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(HPV)的存在与具体基因型，成为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。目前临床上用于人乳头瘤状病毒(HPV)的提前诊断、治疗预后判断方法主要有细胞学、免疫组化与病理学检查、基因检测等。细胞学检查包括传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学检查(TCT)与自动细胞学检测(LCT)等，其优点是操作简便、价格低廉、适宜初步筛查，但存在灵敏度低、特异性差、易受主观因素影响、假阴性率与假阳性率高等缺点，且不能进行HPV分型。免疫组化检查原理明确、操作也相对简便，但存在无免疫应答者或HPV潜伏感染者易漏检等缺点。组织学检查包括肉眼观察、阴道镜观察与病理组织检查等，其优点也是操作简便、价格低廉、适宜初步筛查，但存在准确率低、人员素质要求高、病人痛苦等缺点。分子水平的检测可辅助子宫颈细胞学检查，以筛查是否有高危型HPV16、18型感染。基于HPV核酸检测的分子生物学技术主要包括：第二代杂交捕获法(HC2)、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法与PCR-杂交法等。分子水平检测技术具有准确、可减少病人痛苦等优点，在实验室质量严格控制情况下，已越来越广泛应用于HPV临床检测。现有技术中，已出现利用环介导等温扩增技术来检测人乳头瘤病毒，如申请公布号为CN102952894A的中国专利《基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV6,11,16,18,52,58》公开了一种基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV16的方法，检测过程中，反应前加入HNB(羟基萘酚篮)染料，在63℃等温环境中扩增1小时，用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀，来判定检测结果。但是上述基于颜色的环介导等温扩增技术检测HPV16、HPV18时，检测时间较长，扩增需要1小时，同时在判定过程中用肉眼判定白色沉淀来检测，检测时间长，判定时不是很方便。因此，建立快速简便的16、18亚型人乳头瘤病毒环介导等温扩增技术具有迫切需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种LAMP检测用引物组合，具有检测人乳头瘤病毒16、18亚型L1基因，检测时间短，鉴定结果直观清晰的效果。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种LAMP检测用引物组合，包括HPV16的LAMP检测用引物组，引物名称和序列信息如下，F3，GCCATATCTACTTCAGAAACTACA；B3，TTGCCTGGGTTACAAACC；FIP，TGCAGTTAAGGTTATTTTGCACAGT-TACTAACTTTAAGGAGTACCTACG；BIP，TTCCACTATTTTGGAGGACTGGA-AGTATCTTCTAGTGTGCCTC；HPV18的LAMP检测用引物组，引物名称和序列如下，F3，CACTGTGCCTCAATCCTT；B3，ACTGGGAGTGGTATCTACC；FIP，GGTAACAATAGAGCCACTTGGAGAG-ACAGGTATGCCTGCTTCA；BIP，TGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCA-AATAATTGATTATGCCAGCAAAC。通过采用上述技术方案，F3，上游外引物；B3，下游外引物；FIP，上游内引物；BIP，下游内引物。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplication，简称LAMP)，快速检测样品HPV16、18亚型的方法是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎--环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)过程中，从反应溶液中的绿色荧光出现，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65℃左右)条件下20至30分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。采用本专利技术中的基因诊断方法检测仅需30分钟。并且，本专利技术的反应液中添加了荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。本专利技术的进一步设置为：HPV16的LAMP检测用引物组还包括LF，CTGTAAATCATATTCCTCCCCATGT；LB，TTGGTCTACAACCTCCCCC。通过采用上述技术方案，LF，上游环引物；LB，下游环引物。本专利技术的进一步设置为：HPV18的LAMP检测用引物组还包括LB，GGTTACATAAGGCACAGGGTC。通过采用上述技术方案，LB，下游环引物。本专利技术的另一个目的在于提供一种包含上述LAMP检测用引物组合的反应体系，每25μL的反应体系包含组分如下，20mMTris-HCl(pH8.8)，10mMKCl，8mMMgSO4，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，dNTPs各1.4mM，F3和B3各0.4μM，FIP和BIP各3.2μM，LF和LB各1.6μM，0.3M钙黄绿素，0.5MMnCl2，8UBstDNA聚合酶，2.5μLDNA模板。通过采用上述技术方案，上述反应体系置于反应管内，65℃反应60min，80℃加热5min终止反应，反应过程借助荧光定量PCR仪SYBR通道实时监测，反应结果通过肉眼观察颜色变化和软件生成的荧光曲线进行判断。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术创新地兼顾可视化LAMP的快速、便捷、高特异性、高灵敏度等优势，解决了LAMP易开盖污染的方法学基础问题，构建了实时可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种LAMP检测用引物组合，包括HPV16的LAMP检测用引物组，引物名称和序列信息如下，

【技术特征摘要】
1.一种LAMP检测用引物组合，包括HPV16的LAMP检测用引物组，引物名称和序列信息如下，HPV18的LAMP检测用引物组，引物名称和序列如下，2.根据权利要求1所述的LAMP检测用引物组合，其特征在于：HPV16的LAMP检测用引物组还包括LFCTGTAAATCATATTCCTCCCCATGTLBTTGGTCTACAACCTCCCCC。3.根据权利要求2所述的LAMP检测用引物组合，其特征在于：HPV18的LAMP检测用引物组还包括LBGGTTACAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明洲，方结红，马骉，苏志春，
申请(专利权)人：温州美众医学检验所，
类型：发明
国别省市：浙江,33