荧光定量PCR用引物与探针组合及其反应体系制造技术

本发明专利技术公开了一种荧光定量PCR引物与探针组合及其反应体系。本发明专利技术具有以下优点和效果：作为分子诊断的金标准，荧光定量PCR方法的准确性和稳定性，是其一直作为其他分子生物学技术的参照依据。HPV病毒亚型众多，亚型间的同源相似性较高，区分不同亚型对于HPV的检测鉴定工作具有重大意义。本发明专利技术针对22个不同亚型的HPV病毒，分别设计并筛选出22组特异性引物和与之对应的FAM标记的Taqman探针。适用于生殖泌尿道、宫颈脱落细胞、组织及其他体液的22种亚型人乳头瘤病毒核酸检测。使用Bioline扩增体系，qPCR检测HPV病毒的灵敏度达到10

Combination of primers and probes with fluorescence quantitative PCR and its reaction system

The invention discloses a combination of a fluorescent quantitative PCR primer and a probe and a reaction system. The invention has the following advantages and effects: as the gold standard of molecular diagnosis, the accuracy and stability of the fluorescence quantitative PCR method is a reference basis for other molecular biology technologies. There are many subtypes of HPV virus, and the homologous similarity between subtypes is high. It is of great significance to distinguish different subtypes for the detection and identification of HPV. In this invention, 22 different subtypes of HPV viruses were designed and screened for 22 specific primers and the corresponding FAM labeled Taqman probes. It is suitable for the detection of 22 subtypes of human papillomavirus nucleic acid (HPV) of the genital tract, exfoliated cells, tissues and other body fluids. Using the Bioline amplification system, the sensitivity of qPCR to HPV virus was 10

【技术实现步骤摘要】
荧光定量PCR用引物与探针组合及其反应体系
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种荧光定量PCR用引物与探针组合及其反应体系。
技术介绍
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒属，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区。早期转录区(E区)主要控制病毒的复制和转化功能；晚期转录区(L区)编码病毒的衣壳蛋白；长控制区(LCR区)包含复制起始区和复制转录控制元件。20世纪80年代，德国病毒学家HaraldzurHausen教授首次提出HPV病毒与宫颈癌发病相关的假说之后，经过20多年的科学研究，国际癌症研究所在1995年正式确认，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要病因。依照WHO国际癌症研究机构(IARC)的研究成果，HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73等15种基因型在2005年的专题讨论会议上被正式认定为高危型。因此，检测宫颈细胞样本中人乳头瘤状病毒(HPV)的存在与具体基因型，成为宫颈癌预防及治疗的一种普遍早期诊断方法。目前临床上用于人乳头瘤状病毒(HPV)的提前诊断、治疗预后判断方法主要有细胞学、免疫组化与病理学检查等。细胞学检查包括传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学检查(TCT)与自动细胞学检测(LCT)等，其优点是操作简便、价格低廉、适宜初步筛查，但存在灵敏度低、特异性差、易受主观因素影响、假阴性率与假阳性率高等缺点，且不能进行HPV分型。免疫组化检查原理明确、操作也相对简便，但存在无免疫应答者或HPV潜伏感染者易漏检等缺点。组织学检查包括肉眼观察、阴道镜观察与病理组织检查等，其优点也是操作简便、价格低廉、适宜初步筛查，但存在准确率低、人员素质要求高、病人痛苦等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种荧光定量PCR用引物与探针组合，具有检测22种人乳头瘤病毒亚型时灵敏度高、特异性良好、结果可靠的效果。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种荧光定量PCR用引物与探针组合，包括以下引物与探针组合中的一种或多种，(1)引物与探针组合1，包括SEQIDNO1的引物F、SEQIDNO2的引物R、SEQIDNO3的探针probe；(2)引物与探针组合2，包括SEQIDNO4的引物F、SEQIDNO5的引物R、SEQIDNO6的探针probe；(3)引物与探针组合3，包括SEQIDNO7的引物F、SEQIDNO8的引物R、SEQIDNO9的探针probe；(4)引物与探针组合4，包括SEQIDNO10的引物F、SEQIDNO11的引物R、SEQIDNO12的探针probe；(5)引物与探针组合5，包括SEQIDNO13的引物F、SEQIDNO14的引物R、SEQIDNO15的探针probe；(6)引物与探针组合6，包括SEQIDNO16的引物F、SEQIDNO17的引物R、SEQIDNO18的探针probe；(7)引物与探针组合7，包括SEQIDNO19的引物F、SEQIDNO20的引物R、SEQIDNO21的探针probe；(8)引物与探针组合8，包括SEQIDNO22的引物F、SEQIDNO23的引物R、SEQIDNO24的探针probe；(9)引物与探针组合9，包括SEQIDNO25的引物F、SEQIDNO26的引物R、SEQIDNO27的探针probe；(10)引物与探针组合10，包括SEQIDNO28的引物F、SEQIDNO29的引物R、SEQIDNO30的探针probe；(11)引物与探针组合11，包括SEQIDNO31的引物F、SEQIDNO32的引物R、SEQIDNO33的探针probe；(12)引物与探针组合12，包括SEQIDNO34的引物F、SEQIDNO35的引物R、SEQIDNO36的探针probe；(13)引物与探针组合13，包括SEQIDNO37的引物F、SEQIDNO38的引物R、SEQIDNO39的探针probe；(14)引物与探针组合14，包括SEQIDNO40的引物F、SEQIDNO41的引物R、SEQIDNO42的探针probe；(15)引物与探针组合15，包括SEQIDNO43的引物F、SEQIDNO44的引物R、SEQIDNO45的探针probe；(16)引物与探针组合16，包括SEQIDNO46的引物F、SEQIDNO47的引物R、SEQIDNO48的探针probe；(17)引物与探针组合17，包括SEQIDNO49的引物F、SEQIDNO50的引物R、SEQIDNO51的探针probe；(18)引物与探针组合18，包括SEQIDNO52的引物F、SEQIDNO53的引物R、SEQIDNO54的探针probe；(19)引物与探针组合19，包括SEQIDNO55的引物F、SEQIDNO26的引物R、SEQIDNO57的探针probe；(20)引物与探针组合20，包括SEQIDNO59的引物F、SEQIDNO59的引物R、SEQIDNO60的探针probe；(21)引物与探针组合21，包括SEQIDNO61的引物F、SEQIDNO62的引物R、SEQIDNO63的探针probe；(22)引物与探针组合22，包括SEQIDNO64的引物F、SEQIDNO65的引物R、SEQIDNO66的探针probe。表1本专利技术的另一个目的在于提供一种反应体系，每20μL的反应体系包含组分如下，2×SensiFASTProbeLo-ROX10μL，0.4μM引物F和R各1μL，0.1μM探针probe(FAM标记)1μL，2.5μL模板DNA，剩余体积由ddH2O补足。通过采用上述技术方案，上述反应体系为TaqMan探针法qPCR反应体系，反应程序如下：95℃预变性2min，95℃变性10s，60℃退火延伸26s，40个循环。反应结果当Ct值<35时，判定为阳性。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：作为分子诊断的金标准，荧光定量PCR方法的准确性和稳定性，是其一直作为其他分子生物学技术的参照依据。HPV病毒亚型众多，亚型间的同源相似性较高，区分不同亚型对于HPV的检测鉴定工作具有重大意义。本专利技术针对22个不同亚型的HPV病毒，分别设计并筛选出22组特异性引物和与之对应的FAM标记的Taqman探针。适用于生殖泌尿道、宫颈脱落细胞、组织及其他体液的22种亚型人乳头瘤病毒核酸检测。使用Bioline扩增体系，qPCR检测HPV病毒的灵敏度达到101copies/μL，特异性良好，且无假阳性和假阴性，结果可靠。附图说明图1是本专利技术的HPV6、HPV11、HPV18、HPV26和对应的探针与引物组合的特异性实验扩增曲线；图2是本专利技术的HPV31、HPV33、HPV35、HPV39和对应的探针与引物组合的特异性实验扩增曲线；图3是本专利技术的HPV42、HPV43、HPV45、HPV51和对应的探针与引物组合的特异性实验扩增曲线；图4是本专利技术的HPV51和对应的探针与引物组合的特异性实验扩增曲线；图5是本专利技术的HPV56、HPV58、HPV59、HPV66和对应的探针与引物组合的特异性实验扩增曲线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光定量PCR用引物与探针组合，其特征在于：包括以下引物与探针组合中的一种或多种，(1)引物与探针组合1，包括SEQ ID NO1的引物F、SEQ ID NO2的引物R、SEQ ID NO3的探针probe，(2)引物与探针组合2，包括SEQ ID NO4的引物F、SEQ ID NO5的引物R、SEQ ID NO6的探针probe，(3)引物与探针组合3，包括SEQ ID NO7的引物F、SEQ ID NO8的引物R、SEQ ID NO9的探针probe，(4)引物与探针组合4，包括SEQ ID NO10的引物F、SEQ ID NO11的引物R、SEQ ID NO12的探针probe，(5)引物与探针组合5，包括SEQ ID NO13的引物F、SEQ ID NO14的引物R、SEQ ID NO15的探针probe，(6)引物与探针组合6，包括SEQ ID NO16的引物F、SEQ ID NO17的引物R、SEQ ID NO18的探针probe，(7)引物与探针组合7，包括SEQ ID NO19的引物F、SEQ ID NO20的引物R、SEQ ID NO21的探针probe，(8)引物与探针组合8，包括SEQ ID NO22的引物F、SEQ ID NO23的引物R、SEQ ID NO24的探针probe，(9)引物与探针组合9，包括SEQ ID NO25的引物F、SEQ ID NO26的引物R、SEQ ID NO27的探针probe，(10)引物与探针组合10，包括SEQ ID NO28的引物F、SEQ ID NO29的引物R、SEQ ID NO30的探针probe，(11)引物与探针组合11，包括SEQ ID NO31的引物F、SEQ ID NO32的引物R、SEQ ID NO33的探针probe，(12)引物与探针组合12，包括SEQ ID NO34的引物F、SEQ ID NO35的引物R、SEQ ID NO36的探针probe，(13)引物与探针组合13，包括SEQ ID NO37的引物F、SEQ ID NO38的引物R、SEQ ID NO39的探针probe，(14)引物与探针组合14，包括SEQ ID NO40的引物F、SEQ ID NO41的引物R、SEQ ID NO42的探针probe，(15)引物与探针组合15，包括SEQ ID NO43的引物F、SEQ ID NO44的引物R、SEQ ID NO45的探针probe，(16)引物与探针组合16，包括SEQ ID NO46的引物F、SEQ ID NO47的引物R、SEQ ID NO48的探针probe，(17)引物与探针组合17，包括SEQ ID NO49的引物F、SEQ ID NO50的引物R、SEQ ID NO51的探针probe，(18)引物与探针组合18，包括SEQ ID NO52的引物F、SEQ ID NO53的引物R、SEQ ID NO54的探针probe，(19)引物与探针组合19，包括SEQ ID NO55的引物F、SEQ ID NO26的引物R、SEQ ID NO57的探针probe，(20)引物与探针组合20，包括SEQ ID NO59的引物F、SEQ ID NO59的引物R、SEQ ID NO60的探针probe，(21)引物与探针组合21，包括SEQ ID NO61的引物F、SEQ ID NO62的引物R、SEQ ID NO63的探针probe，(22)引物与探针组合22，包括SEQ ID NO64的引物F、SEQ ID NO65的引物R、SEQ ID NO66的探针probe。...

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR用引物与探针组合，其特征在于：包括以下引物与探针组合中的一种或多种，(1)引物与探针组合1，包括SEQIDNO1的引物F、SEQIDNO2的引物R、SEQIDNO3的探针probe，(2)引物与探针组合2，包括SEQIDNO4的引物F、SEQIDNO5的引物R、SEQIDNO6的探针probe，(3)引物与探针组合3，包括SEQIDNO7的引物F、SEQIDNO8的引物R、SEQIDNO9的探针probe，(4)引物与探针组合4，包括SEQIDNO10的引物F、SEQIDNO11的引物R、SEQIDNO12的探针probe，(5)引物与探针组合5，包括SEQIDNO13的引物F、SEQIDNO14的引物R、SEQIDNO15的探针probe，(6)引物与探针组合6，包括SEQIDNO16的引物F、SEQIDNO17的引物R、SEQIDNO18的探针probe，(7)引物与探针组合7，包括SEQIDNO19的引物F、SEQIDNO20的引物R、SEQIDNO21的探针probe，(8)引物与探针组合8，包括SEQIDNO22的引物F、SEQIDNO23的引物R、SEQIDNO24的探针probe，(9)引物与探针组合9，包括SEQIDNO25的引物F、SEQIDNO26的引物R、SEQIDNO27的探针probe，(10)引物与探针组合10，包括SEQIDNO28的引物F、SEQIDNO29的引物R、SEQIDNO30的探针probe，(11)引物与探针组合11，包括SEQIDNO31的引物F、SEQIDNO32的引物R、SEQIDNO33的探针probe，(12)引物与探针组合12，包括SEQIDNO34的引物F、SEQIDNO35的引物R、SEQIDNO36的探针probe，(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明洲，方结红，马骉，苏志春，
申请(专利权)人：温州美众医学检验所，
类型：发明
国别省市：浙江,33