用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用技术

本申请公开了一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的N9亚型禽流感病毒检测试剂，包括引物对和探针，引物对上下游引物分别为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者其反向互补序列；SEQ ID No.3所示的探针序列中，第34碱基修饰6‑荧光基团‑dT，第38碱基替换为dSpacer，第39碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，3’端修饰C3 Spacer。本申请的试剂，能通过重组酶聚合酶扩增对N9亚型禽流感病毒进行灵敏、特异、高效检测。与现有检测方法相比，本申请的试剂和检测方法，时间短，易操作，可快速得出结论，适于现场检测，对N9亚型禽流感病毒的快速防控具有重大意义。

Reagents, detection methods and applications for detection of N9 subtype avian influenza virus

The present application discloses a reagent, detection method and application for the detection of N9 subtype avian influenza virus. N9 subtype avian influenza virus detection reagent of the application, including primers and probes, primers primers were Seq ID and Seq No.1 ID No.2 shown in sequence, as shown by Seq ID probe No.3 sequence or its reverse complementary sequence; SEQ ID probe sequence No.3 in thirty-fourth, 6 fluorophore modified bases dT, thirty-eighth base substitutions for dSpacer, thirty-ninth base modification in the fluorescence quenching group dT, 3 'end modified C3 Spacer. The reagents used in this application can be used to detect the N9 subtype avian influenza virus by recombinant enzyme polymerase for sensitive, specific and efficient detection. Compared with the existing detection methods, the reagents and detection methods in this application are short in time, easy to operate, quick to draw conclusions, suitable for on-site detection, and of great significance for the rapid prevention and control of N9 subtype avian influenza virus.

【技术实现步骤摘要】
用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用
本申请涉及N9亚型禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。
技术介绍
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)属于正黏病毒科、A型流感病毒属，为单股负链RNA，分为8个独立的RNA节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2等10个蛋白。AVI显著的生物学特征之一是亚型众多,变异频繁。根据血凝素(Hemagglutinin,HA)与神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原性不同，可分为16个HA亚型(H1～H16)和9个NA亚型(N1～N9)，不同亚型毒株对宿主的致病力差异很大。2013年3月中国首次出现人感染H7N9亚型流感病例，经过国家禽流感参考实验室证实，此次禽流感疫情由全球首次发现的H7N9新型流感病毒引起，同时证实H7N9亚型禽流感病毒是一种新的重配病毒，能导致人类发生严重或致命的呼吸系统疾病。根据国家卫生计生委疾病预防控制局发布的法定传染病疫情概况，2013年3月至2017年6月，人感染H7N9禽流感发病数累计1445例，死亡数562例，严重威胁人类健康，引起了全世界的关注。其中，仅2017年上半年，人感染H7N9禽流感发病数累计636例，死亡数261例，可见当前H7N9禽流感疫情防控形势严峻。因此，开展N9亚型流感病毒的特异、敏感、快速的检测工作具有重要意义。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-GCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAAC-3’SeqIDNo.2：5’-TGCAGATGCATTGTTGTTTGGTCCTGATAT-3’SeqIDNo.3：5’-CAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACC-3’其中，SEQIDNo.3所示的探针序列中，第34个碱基修饰6-荧光基团-dT，第38个碱基替换为碱基类似物，第39个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3Spacer。需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针是针对N9亚型禽流感病毒设计的，特别用于重组酶聚合酶扩增的引物和探针。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常用的PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，例如引物长度一般为30～35bp，引物设计应尽量避免易形成二级结构、引物-引物相互作用、发夹结构，扩增产物不超过500bp，探针长度一般为46-52bp，且在碱基类似物5’端至少有30个碱基等原则，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，针对不同的靶标设计了2条上游引物、2条下游引物和2条探针进行试验筛选，最终筛选出SeqIDNo.1所示序列和SeqIDNo.2所示序列的引物对和SEQIDNo.3所示序列的探针，作为本申请的N9亚型禽流感病毒检测试剂。还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQIDNo.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。优选的，6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。优选的，碱基类似物为dSpacer。优选的，荧光淬灭基团-dT为BHQ1-dT。需要说明的是，根据探针的设计原则，只需要在碱基类似物的两端分别修饰荧光基团和荧光淬灭基团即可，本申请的优选方案中，优选的使用FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团。可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。优选的，本申请用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂中，还包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。需要说明的是，本申请的试剂，是特别针对N9亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂中完全可以进一步的包括用于重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为RehydrationBuffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc。本申请的另一面公开了本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂在N9亚型禽流感病毒检测中的应用。本申请的另一面公开了本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂在制备N9亚型禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。本申请的再一面公开了一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂。本申请的再一面公开了一种N9亚型禽流感病毒的检测方法，包括采用本申请的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，对待测样品的核酸进行重组酶聚合酶扩增检测，并采用荧光检测仪收集荧光。需要说明的是，本申请的检测方法，通过重组酶聚合酶扩增对N9亚型禽流感病毒进行快速检测，一方面，重组酶聚合酶扩增检测速度快，只需要十几二十分钟就可以完成检测；另一方面，整个检测只需要在相对较低的恒温下就可以完成，例如采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪即可。因此，本申请检测方法特别适合于N9亚型禽流感病毒的现场快速检测，为疫病的快速检测和防控提供有力的科学依据。优选的，重组酶聚合酶扩增的反应条件为，40℃恒温反应20分钟。需要说明的是，RPA所采用的酶的活性在37℃左右，RPA通常十几分钟或者在十分钟内就可以完成检测；但是，本申请优选的方案中，为了保障检测结果的准确性，优选在40℃恒温反应20分钟。本申请的有益效果在于：本申请用于N9亚型禽流感病毒检测的试本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；Seq ID No.1：5’‑GCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAAC‑3’Seq ID No.2：5’‑TGCAGATGCATTGTTGTTTGGTCCTGATAT‑3’Seq ID No.3：5’‑CAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACC‑3’其中，SEQ ID No.3所示的探针序列中，第34个碱基修饰6‑荧光基团‑dT，第38个碱基替换为碱基类似物，第39个碱基修饰荧光淬灭基团‑dT，3’端修饰C3Spacer。

【技术特征摘要】
1.一种用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，所述引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-GCTCTCAGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAAC-3’SeqIDNo.2：5’-TGCAGATGCATTGTTGTTTGGTCCTGATAT-3’SeqIDNo.3：5’-CAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACC-3’其中，SEQIDNo.3所示的探针序列中，第34个碱基修饰6-荧光基团-dT，第38个碱基替换为碱基类似物，第39个碱基修饰荧光淬灭基团-dT，3’端修饰C3Spacer。2.根据权利要求1所述的用于N9亚型禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述6-荧光基团-dT为6-FAM-dT。3.根据权利要求1所述的用于N9亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹琛福，秦智锋，林彦星，阮周曦，王潇，黄超华，陶虹，刘建利，陈兵，曾少灵，吕建强，杨俊兴，花群义，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，深圳市检验检疫科学研究院，清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东,44