一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，活性因子的制备为：取P3代胎盘亚全能干细胞，接种，消化，冰上超声破碎细胞，收集上清液；然后滴入三氯乙酸，冰浴，低温离心，弃上清；加预冷的丙酮洗涤沉淀，低温离心，弃丙酮后，重悬沉淀，0.1μM的滤膜过滤，所得的SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF浓度均大于20000pg/ml。本发明专利技术采用无异源性动物血清的培养体系，减少引入异源性动物病毒的风险；同时培养体系中不含任何激素，避免激素可能引起的皮肤过敏反应；并使用低温沉淀的方法制备活性因子，保证了活性因子的活性。

A kind of placental subtotal energy stem cell active factor for beauty and skin care and its preparation and Application

The invention relates to a method for preparing placenta beauty skin care for pluripotent stem cell activity factor, including placental pluripotent stem cells were isolated, cultured and activated factor preparation, preparation for the activity factor system: P3 placental pluripotent stem cells, inoculation, digestion, ice ultrasonic cell the supernatant was collected, and then drops three; chloroacetic acid, ice bath, centrifugation, supernatant; pre cold acetone washing precipitation, centrifugation, and acetone, suspending precipitation, filtration of 0.1 M, the SCF, FGF, VEGF, EGF alpha and KGF concentrations were greater than 20000pg/ml. The invention adopts a serum-free culture system for heterologous animal, reduce the risk of introducing heterologous animal virus does not contain any hormone; at the same time training system, to avoid skin allergy caused by hormone; activated factor and use method of low temperature precipitation system, ensure the active factor activity.

【技术实现步骤摘要】
一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用。
技术介绍
干细胞由于具有可以分化为其他组织类型的细胞而被称为万能细胞，已经成为再生医学领域的研究热点。近年来的研究提示，在成体组织中存在一种和造血干细胞、神经干细胞等只能分化为特定胚层的多能干细胞不同的原始干细胞群，这类原始干细胞群可分化为不同胚层的组织细胞。此外，它们也区别于胚胎干细胞，在生长发育中逐渐失去部分分化潜能，并且表现出一些特殊表型或者分子标志，这类原始干细胞群被称为亚全能干细胞。亚全能干细胞的分化潜能仅次于全能干细胞，处于干细胞等级的最上层，它们在胚胎期存在于一些或全部的组织和器官中，可分化为不同类型的多能干细胞，在体外具有分化成三胚层来源的组织细胞的能力，且无致瘤性。可以参与机体自我修复和更新，不仅能分化为所在器官的组织特异性细胞，参与器官重塑，也可以在炎症因子或者生长因子的趋化作用下，远处转移修复受损组织。胎盘亚全能干细胞除了通过分化为特定的细胞来参与机体自我修复和更新外，还可以通过分泌活性因子来发挥作用。其分泌的因子主要包括：干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、神经细胞生长因子(NGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)转化生长因子β1(TGF-β1)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、集落形成刺激因子(CSF)、内皮生长因子(VEGF)、各类白介素(IL1-19)和胶原蛋白等，这些活性因子在皮肤抗衰、美白、祛皱中发挥了重要的作用。目前市面上的美容护肤产品多为精细化工产品，有效改善皮肤生理状态的效果并不理想，且长期使用的副作用大。本专利技术公开了一种美容护肤用胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，包括：胎盘亚全能干细胞的分离和培养方法以及活性因子的制备方法。本专利技术采用无异源性动物血清的培养体系，减少引入异源性动物病毒的风险；同时培养体系中不含激素，避免激素可能引起的皮肤过敏。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用，以解决了现有技术中的不足。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现：一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，所述制备方法包括以下步骤；S1：分离：分离胎盘表面的羊膜组织，将羊膜组织置于含有抗生素的PBS的培养皿；S2：将羊膜组织清洗干净，剪成小块后转移至离心管中，并向离心管中加入0.25％的胰蛋白酶，然后置于摇床内振荡消化10～20min；振荡消化完毕后，去除消化上清液；S3：去掉上清消化液后向剩余组织中加入含有Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的消化液，然后振荡消化；S4：将消化所得的细胞悬液过滤，离心后收集细胞；S5：取步骤S4中所收集的细胞，弃上清，加入2mL完全培养基，混合均匀，则整体呈细胞悬浮液状态；S6：将步骤S5中的细胞悬浮液接种至培养瓶中，37℃、5％CO2培养；第2天换液，以后每2天换液1次，直至可以进行传代；S7：进行细胞传代时，弃细胞培养液，洗涤，消化，离心，然后按(0.7～1.5)x105/ml的密度传代培养，传代至P1和P3代时细胞，即得到P3代的胎盘亚全能干细胞的；S8：取步骤S7中所得的P3代胎盘亚全能干细胞，以(1～3)x106/瓶的密度接种在培养瓶中，然后进行消化，洗涤；将洗涤后的细胞重悬，冰上超声破碎细胞，然后收集上清液并将转移至新的离心管中；S9：将三氯乙酸缓慢滴入步骤S8所得的上清液中，轻轻混匀，冰浴40～80min，低温离心10～30min，弃上清；加入0.3～0.7ml预冷的丙酮洗涤沉淀，低温离心10～30min，按此方法用丙酮重复洗涤至少3次；最后一步离心并吸弃丙酮后，室温放置，加入0.7～1.5mlddH2O重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤，-80℃冻存备用，即得高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子；所得的高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。进一步地，步骤S8中，以2x106/瓶的密度接种在培养瓶中，48h后收集培养液至离心管中，然后加0.25％胰酶消化细胞，并用PBS洗涤细胞2次；将洗涤后的细胞用所收集的培养液重悬，以2000rpm/10min冰上超声破碎细胞10min。进一步地，步骤S9中，所述三氯乙酸与上清液的体积比为三氯乙酸:上清＝1:9，二者混匀后，冰浴55～65min，12000rpm/min4℃低温离心20min，弃上清，加入0.5ml预冷的丙酮洗涤沉淀，12000rpm/min4℃低温离心20min，按此方法用丙酮重复洗涤5次，最后一步离心吸弃丙酮后，室温放置10min，加入ddH2O1ml重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤。进一步地，所述预冷的丙酮为丙酮事先放入-20℃冰箱冷冻至少1h以上。进一步地，步骤S1中，所述抗生素包括1％青霉素和1％链霉素；步骤S2中，加入胰蛋白酶后将离心管置于摇床内37℃、250rpm/min振荡消化15min，振荡消化完毕后，去除消化上清液，并用此方法重复消化3次，弃上清消化液；步骤S3中，向剩余组织中加入含有0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的消化液，然后在37℃、80rpm/min振荡消化60min；步骤S4中，细胞悬液用100目滤网过滤，1200rpm/min离心10min收集细胞；步骤S6中，按照2×106个细胞/瓶的接种量接种至多个T175培养瓶；步骤S7中，细胞汇合度达80％-90％时即可进行细胞传代，然后弃细胞培养液、洗涤，加0.5ml0.25％的胰酶消化3min，吹打收集细胞后1200rpm/min离心3min，按1x105/ml的密度传代培养。进一步地，步骤S2中，所述羊膜组织与胰蛋白酶的体积比为：羊膜组织:胰蛋白酶＝1:2；步骤S3中，所述消化液的加量为：xx，该消化液中0.2％Ⅰ型胶原酶和0.1％中性蛋白酶的含量为xx；步骤S5中，所述完全培养基包括58％DMEM、40％MCDB、2％脐血血浆、2mmol/L谷氨酰胺、10ng/mlEGF、10ng/mlbFGF、5ng/mlLA-BSA、0.1mmol/L亚硒酸钠、0.1mmol/LVitaminC。进一步地，所述脐血血浆的制备方法为：将脐血转到离心管中，2000rpm/min离心15min，取上层黄色血浆至新的50ml离心管中，56℃灭活30min。一种根据上述方法所制备的胎盘亚全能干细胞活性因子，所述胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。一种胎盘亚全能干细胞活性因子在美容护肤中的应用。一种面膜液，其包括制作面膜的面膜水和胎盘亚全能干细胞活性因子，所述胎盘亚全能干细胞活性因子与面膜水的体积比为：1:20。本专利技术至少具有以下有益效果：本专利技术给出了一种容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子及其制备与应用，通过对胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及对活性因子的制备等具体过程，从而得到了包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF等在内的胎盘亚全能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；S1：分离：取胎盘表面的羊膜组织，将羊膜组织置于含有抗生素的PBS的培养皿；S2：将羊膜组织清洗干净，剪成小块后转移至离心管中，并向离心管中加入0.25％的胰蛋白酶，然后置于摇床内振荡消化10～20min；振荡消化完毕后，去除消化上清液；S3：去掉上清消化液后向剩余组织中加入含有Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的消化液，然后振荡消化；S4：将消化所得的细胞悬液过滤，离心后收集细胞；S5：取步骤S4中所收集的细胞，弃上清，加入2mL完全培养基，混合均匀，则整体呈细胞悬浮液状态；S6：将步骤S5中的细胞悬浮液接种至培养瓶中，37℃、5％CO2培养；第2天换液，以后每2天换液1次，直至可以进行传代；S7：进行细胞传代时，弃细胞培养液，洗涤，消化，离心，然后按(0.7～1.5)x10

【技术特征摘要】
1.一种美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其包括胎盘亚全能干细胞的分离、培养以及活性因子的制备，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤；S1：分离：取胎盘表面的羊膜组织，将羊膜组织置于含有抗生素的PBS的培养皿；S2：将羊膜组织清洗干净，剪成小块后转移至离心管中，并向离心管中加入0.25％的胰蛋白酶，然后置于摇床内振荡消化10～20min；振荡消化完毕后，去除消化上清液；S3：去掉上清消化液后向剩余组织中加入含有Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的消化液，然后振荡消化；S4：将消化所得的细胞悬液过滤，离心后收集细胞；S5：取步骤S4中所收集的细胞，弃上清，加入2mL完全培养基，混合均匀，则整体呈细胞悬浮液状态；S6：将步骤S5中的细胞悬浮液接种至培养瓶中，37℃、5％CO2培养；第2天换液，以后每2天换液1次，直至可以进行传代；S7：进行细胞传代时，弃细胞培养液，洗涤，消化，离心，然后按(0.7～1.5)x105/ml的密度传代培养，传代至P1和P3代时细胞，即得到P3代的胎盘亚全能干细胞的；S8：取步骤S7中所得的P3代胎盘亚全能干细胞，以(1～3)x106/瓶的密度接种在培养瓶中，然后进行消化，洗涤；将洗涤后的细胞重悬，冰上超声破碎细胞，然后收集上清液并将转移至新的离心管中；S9：将三氯乙酸缓慢滴入步骤S8所得的上清液中，轻轻混匀，冰浴40～80min，低温离心10～30min，弃上清；加入0.3～0.7ml预冷的丙酮洗涤沉淀，低温离心10～30min，按此方法用丙酮重复洗涤至少3次；最后一步离心并吸弃丙酮后，室温放置，加入0.7～1.5mlddH2O重悬沉淀，并用0.1μM的滤膜过滤，-80℃冻存备用，即得高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子；所得的高度浓缩的胎盘亚全能干细胞活性因子中包括SCF、αFGF、VEGF、EGF和KGF，且其浓度均大于20000pg/ml。2.根据权利要求1所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：步骤S8中，以2x106/瓶的密度接种在培养瓶中，48h后收集培养液至离心管中，然后加0.25％胰酶消化细胞，并用PBS洗涤细胞2次；将洗涤后的细胞用所收集的培养液重悬，以2000rpm/10min冰上超声破碎细胞10min。3.根据权利要求2所述的美容护肤用的胎盘亚全能干细胞活性因子的制备方法，其特征在于：步骤S9中，所述三氯乙酸与上清液的体积比为三氯乙酸:上清＝1:9，二者混匀后，冰浴55～65min，12000rpm/min4℃低温离心20min，弃上清，加入0.5ml预冷的丙酮洗涤沉淀，12000rpm/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：李陶，张晓文，
申请(专利权)人：奥尔文深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44