一种胚胎体外培养方法技术

本发明专利技术公开了一种胚胎体外培养方法，具体步骤如下：1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；3)混合液中加入SOF‑HEPES，然后移至平皿中，将胚胎清洗多次后，放入步骤1)的培养皿中，培养第3天加入5％血清，待囊胚形成即可。本发明专利技术的一种胚胎体外培养方法中主要是去除矿物油的添加，解决覆盖矿物油对添加药物吸附的影响，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。

An in vitro culture method of embryo

The invention discloses a method for culturing embryos in vitro, the specific steps are as follows: 1) in embryo culture before the embryo culture medium in a Petri dish, in CO2, O2 and N2 balance atmosphere; 2) fertilized eggs into hyaluronidase, still draw part discard supernatant liquid, residual liquid get the mixture in shock oscillator; 3) adding SOF HEPES mixture, and then moved to a Petri dish, the embryo washed repeatedly, in step 1) in a Petri dish and cultured for third days with 5% serum, blastocyst formation can be. The cultivation of a in vitro method of the present invention is to add the removal of mineral oil, mineral oil to solve the cover effect on adding drug adsorption, the real effect of the drug to be reflected, and no mineral oil added to the culture system can achieve the anticipated effect of in vitro embryo culture.

【技术实现步骤摘要】
一种胚胎体外培养方法
本专利技术属于胚胎培养
，具体涉及一种胚胎体外培养方法。
技术介绍
卵母细胞体外培养是胚胎体外生产的主渠道，培养的效果受动物品种、培养液成份、操作熟练程度等多种因素影响。目前，动物卵母细胞体外培养通常是在四孔培养板或培养皿中添加培养液并在培养液上方覆盖矿物油进行培养。但是在实际试验中我们发现矿物油会对培养液中添加的部分药物具有吸附作用，降低添加药物的作用效果，掩盖添加药物对牛胚胎发育的真实效果。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种胚胎体外培养方法。本专利技术的方法通过在胚胎体外培养方法中在培养液上方不覆盖矿物油的方法，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种牛胚胎体外培养方法。本专利技术还要解决的技术问题是提供了所述的培养方法培养得到的胚胎。技术方案：为了解决上述问题，本专利技术提供了一种胚胎体外培养方法，包括以下步骤：1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；3)混合液中加入800～1000μl预先在二氧化碳培养箱中平衡处理的SOF-HEPES液体，然后用移液枪将含有SOF-HEPES的混合液移至平皿中，将胚胎清洗多次后，放入步骤1)所述的培养皿中，培养第3天加入3～5％血清，待囊胚形成即可。其中，上述步骤1)的胚胎培养液的主要组成成分是KSOMaa和BSA。KSOM培养基添加氨基酸，是一个成形产品，购买公司为ZenithBiotech，购买网址链接http://www.zenithbiotech.com/MediaForEmbryoCulture.html。其中，上述BSA在胚胎培养液中的浓度为4mg/ml。其中，上述步骤1)的培养皿为4孔培养皿，每孔胚胎培养液有300～500μl。其中，上述步骤2)的透明质酸酶加入量为500～600μl，所述透明质酸酶浓度为1.0mg/ml。其中，上述步骤3)中的胚胎清洗次数为3次，胚胎清洗方法为：分别用移液枪吸取SOF-HEPES液体100～200μl，做成液滴1和液滴2，用移液枪吸取预先在二氧化碳培养箱中平衡处理2h以上的胚胎培养液100～200μl，做成液滴3，用拣卵针在体式显微镜下拣取含有SOF-HEPES的混合液中的受精卵至液滴1，再用拣卵针将受精卵从液滴1中拣取至液滴2，再从液滴2中拣取至液滴3，共完成3次清洗。其中，在胚胎体外培养过程中胚胎培养液每天进行更换新鲜的胚胎培养液。其中，上述胚胎为牛胚胎或小鼠胚胎，但本专利技术的方法并不仅限于牛或小鼠的胚胎，其他动物的胚胎均适用。本
技术实现思路
还包括所述的培养方法培养得到的胚胎。有益效果：本专利技术相对于现有技术，具有以下优点：本专利技术的一种胚胎体外培养方法中主要是在常规培养方法中去除矿物油的添加，解决覆盖矿物油对添加药物吸附的影响，使添加药物的真实作用效果得以体现，同时无矿物油添加培养体系也能达到体外胚胎培养的预期效果。附图说明图1、牛卵母细胞体外培养程序流程图。具体实施方式为了进一步理解本专利技术，通过结合实施例和附图进一步详述本专利技术的特点和优点。所该实施例仅是对本专利技术的解释，不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。实施例1：本专利技术利用无矿物油添加培养体系开展牛胚胎体外培养，具体方法如下：1.准备工作在胚胎培养前3小时准备胚胎培养液，准备4孔培养皿，每孔500μl培养液，每孔放50个胚胎，无须覆盖矿物油，放入5％CO2、5％O2和平衡N2中；2.胚胎体外培养操作将受精卵收集好后，放入含600μl的透明质酸酶中，沉淀30s，吸取上清液体至100μl，震荡器上震荡5min；加入1mlSOF-HEPES到离心管中，将所有液体移至1000mm平皿中，将胚胎清洗3次后(胚胎清洗方法参见说明书
技术实现思路
部分)，放入上述胚胎培养板中，培养第3天加入5％血清，第7天判断囊胚形成率。表1SOF-HEPES(500ml)配置成分货号浓度添加量NaClS5886107.7mM3.145gKClP54057.16mM0.265gKH2PO4P56551.19mM0.080gMgCl2-6H2OM23930.49mM0.05gNaLactateL4263(liquid)5.3mM0.379mLCaCl2-2H2OC79021.71mM0.125gFructoseF35100.5mM0.045gHEPESH403421mM2.979gMEM-NEAAM71451X2.5mLBME-EAAB67661X5mLNaHCO3S57614mM0.168gNapyruvateP45620.33mM0.018gGlutamax(Gibco)350501mM2.5mLBSAA-33111mg/mL0.5gGentamicin(10mg/mLstock)G-13975ug/mL2.5mLWaterW1503To500mL上述所有涉及药品和水均购自Sigma公司，所有药品加450ml水后开始调节PH值至7.4后，加水至500ml即可，过滤储存。3、添加不同剂量的透明质酸酶对胚胎发育的影响表2不同剂量的透明质酸酶对胚胎发育的影响4、添加不同浓度的FBS(犊牛血清)对囊胚发育的影响表3不同浓度的FBS(犊牛血清)对囊胚发育的影响对比例1常规牛胚胎培养方法：将受精卵用移液枪移入1.5ml的离心管中，在震荡器上震荡1分钟，将受精卵用SOF-HEPES充分洗涤2次，再用胚胎培养液洗涤1次，每25个受精卵移入已平衡2h以上覆盖矿物油的50μl胚胎培养微滴中培养，在培养第3天加5％左右的犊牛血清，第7天评估胚胎的发育情况。实验例1我们利用GSK-J4(一种细胞可渗透前药，其是组蛋白3第27位赖氨酸上三甲基化脱甲基酶的抑制剂)添加到牛胚胎培养液中，检验其对胚胎发育的影响，结果发现了矿物油对添加药物的吸附作用，具体胚胎发育率(％)结果如下：(一)培养期间不更换培养液在无矿物油覆盖和有矿物油覆盖的实验中，在牛胚胎发育至2细胞、4细胞、8细胞和囊胚等4个阶段的比率基本一致，说明是否添加矿物油覆盖培养液对于牛胚胎发育结果没有影响，从而证明的无矿物油添加的牛胚胎培养体系的可行性。结果如表4。表4胚胎培养液中不添加GSK-J4在第一个实验的基础上，我们在培养液中添加5μm浓度的GSK-J4，观察GSK-J4对牛胚胎的发育影响，结果显示，培养液上方无矿物油覆盖组中5μmGSK-J4能够显著抑制牛胚胎发育至4细胞、8细胞和囊胚，而有矿物油覆盖组其4细胞、8细胞和囊胚的形成率明显高于无矿物油覆盖组。说明：5μm浓度的GSK-J4在无矿物油覆盖的培养体系中能够起到抑制牛胚胎发育的效果，而添加矿物油覆盖组的高发育率印证了矿物油对于添加药物的吸附效果，导致影响减弱。结果如表5。表5胚胎培养液中添加浓度为5μmGSK-J4我们也添加了10μm和15μm浓度的GSK-J4，影响牛胚胎发育的趋势与5μm组类似，再次验证了添加矿物油覆盖组的高发育率源于矿物油对于添加药物的吸附效果，导致其影响减弱。具体结果见表6和7。表6胚胎培养液中添加浓度为10μmGSK-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胚胎体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；3)混合液中加入800～1000μl预先在二氧化碳培养箱中平衡处理的SOF‑HEPES液体，然后用移液枪将含有SOF‑HEPES的混合液移至平皿中，将胚胎清洗多次后，再用拣卵针将清洗后的胚胎放入步骤1)所述的培养皿中，培养第3天加入3～5％血清，待囊胚形成即可。

【技术特征摘要】
1.一种胚胎体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：1)在胚胎培养前将胚胎培养液放入培养皿中，置于CO2、O2和平衡N2的气氛中；2)将受精卵放入透明质酸酶中，静止，吸取部分上清液体弃掉，剩余液体在震荡器上震荡得到混合液；3)混合液中加入800～1000μl预先在二氧化碳培养箱中平衡处理的SOF-HEPES液体，然后用移液枪将含有SOF-HEPES的混合液移至平皿中，将胚胎清洗多次后，再用拣卵针将清洗后的胚胎放入步骤1)所述的培养皿中，培养第3天加入3～5％血清，待囊胚形成即可。2.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述步骤1)的胚胎培养液的主要组成成分为KSOMaa和BSA。3.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，所述步骤1)的培养皿为4孔培养皿，每孔胚胎培养液有300～500μl。4.根据权利要求1所述的一种胚胎体外培养方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁威，汤静，陈军，邢军，刘晨，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32