一种胎盘潜能细胞及其培养方法技术

本发明专利技术提供一种胎盘潜能细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态；及(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖并具有干细胞特性的细胞。本发明专利技术而且找到了能维持、支持、潜能细胞的生命物质，用生命物质代替药物；可以通过组织器官的复制，及时生理性修补组织器官，维持生命器官的平衡，治疗疑难顽症和疾病，使病人摆脱医疗痛苦和损伤；并有望用顺应细胞调控的方法，攻克癌症。

【技术实现步骤摘要】
一种胎盘潜能细胞及其培养方法
本专利技术涉及一种潜能细胞及其培养方法，尤其是一种来源于动物胎盘的潜能细胞及其培养方法。
技术介绍
20世纪末以来，生命科学研究发现：干细胞可在体外培养成人体的各个器官特征的细胞/组织。因此，体外培养“建造器官”，有望在不久的将来进行“自体器官”移植治疗疾病；或者，将干细胞注射在人体的某一部位，让干细胞在局部发挥一个器官的功能，最终实现对疾病的治疗。但在干细胞的培养过程中，体外干细胞培养技术受限于干细胞的迅速老化和自我分化并失去其干细胞的干性。现有技术中，细胞培养是指模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使细胞生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。细胞培养的环境要求无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞缺失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。细胞培养的温度是维持培养细胞旺盛生长的另一条件，培养时要求有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。气体也是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。培养时一般把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。细胞培养液pH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止pH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养时能维持较恒定的pH值。再者，细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生长、增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基。(1)合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用时细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。(2)天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用浓度最为5-20％。体外培养细胞根据它们在培养器皿中是否能贴附于支持物上的生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，常见的贴附型细胞是成纤维型细胞、上皮型细胞生长和游走型细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。1、成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维型细胞。本型细胞因形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。2、上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连呈单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。3、游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。常见于羊水细胞培养的早期。培养细胞形态分析培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒和空泡等，表明细胞代谢不良。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种胎盘来源的潜能细胞，命名为胎盘潜能细胞，它是具有干细胞增殖潜能并以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。本专利技术的又一目的在于提供一种胎盘来源的潜能细胞培养方法。本专利技术的另一目的在于提供一种细胞生长调节剂，它用于体外细胞培养，尤其是人的细胞培养。本专利技术的另一目的在于提供一种含有本专利技术细胞生长调节剂的培养基。本专利技术的再一目的在于提供一种经本专利技术方法在体外培养得到胎盘潜能细胞的用途。相应地，为达到以上目的，本专利技术提供一种本专利技术涉及一种体外能够连续增殖的人胎盘潜能细胞，其特征在于，它是具有干细胞增殖潜能的、以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。该胎盘潜能细胞的培养方法包括如下步骤：(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态。(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖并具有干细胞特性的细胞。优选地，增殖后的细胞在体外诱导的条件下，形成各种组织。优选地，所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：(2-A)将所述胎盘组织用至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素冷磷酸缓冲液(PBS)连续洗涤至少2次，每次30秒至3分钟；(2-B)将所述胎盘组织置于含双抗的完全培养液中冲洗至少2次，每次30秒至3分钟；(2-C)将所述胎盘组织剪成极小的器官型植块，大小约1-5mm3；(2-D)将植块置于培养板的培养孔中央，间隔约1-5mm，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的表面；(2-E)沿着培养孔的边缘，每孔中加入约0.1-1.0ml的完全培养液，勿使培养液与植块接触；(2-F)将培养板置于37℃，1-10％CO2培养箱中预孵育0.5-2小时；(2-G)每个培养孔加完全培养液，轻拿轻放，切勿使植块飘起，加细胞生长调节剂。优选地，所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：(2-a)为将组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤至少3次，每次30秒至3分钟,然后将此组织块切成1-5mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.1-0.5％中性蛋白酶溶液或者0.5-2％胶原酶溶液中消化，条件是36.5-37℃恒温振荡，时间0.5-3小时；(2-b)用加样器或者吸管反复吹打组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止,将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液的混合物静置2-8分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，用不锈钢滤网过滤此上清一次，得一消化酶和细胞混合物；(2-c)在4℃条件本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态。(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖为具有干细胞特性的细胞。

【技术特征摘要】
1.一种胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)在无菌条件下获取胎盘细胞和/或组织；(2)将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养，并在所述培养基中加入细胞生长调节剂，以使胎盘潜能细胞生长使所述胎盘细胞和/或组织进入增殖状态。(3)培养所述胎盘潜能细胞，使其持续增殖为具有干细胞特性的细胞。2.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，进一步包括步骤：增殖后的细胞在体外诱导的条件下，形成各种组织。3.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：(2-A)将所述胎盘组织用至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素冷磷酸缓冲液(PBS)连续洗涤至少2次，每次30秒至3分钟；(2-B)将所述胎盘组织置于含双抗的完全培养液中冲洗至少2次，每次30秒至3分钟；(2-C)将所述胎盘组织剪成极小的器官型植块，大小约1-5mm3；(2-D)将植块置于培养板的培养孔中央，间隔约1-5mm，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的表面；(2-E)沿着培养孔的边缘，每孔中加入约0.1-1.0ml的完全培养液，勿使培养液与植块接触；(2-F)将培养板置于37℃，1-10％CO2培养箱中预孵育0.5-2小时；(2-G)每个培养孔加完全培养液，轻拿轻放，切勿使植块飘起，加细胞生长调节剂。4.根据权利要求1所述的胎盘潜能细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中将所述胎盘细胞和/或组织接种在培养基中培养包括如下步骤：(2-a)为将组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有至少两种抗生素包括：青霉素和链霉素的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤至少3次，每次30秒至3分钟,然后将此组织块切成1-5mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.1-0.5％中性蛋白酶溶液或者0.5-2％胶原酶溶液中消化，条件是36.5-37℃恒温振荡，时间0.5-3小时；(2-b)用加样器或者吸管反复吹打组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止,将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液的混合物静置2-8分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织，将含大量细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张继岗，王灏川，
申请(专利权)人：上海聚仁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31