肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种肝癌组织中具备致瘤潜能的细胞团的分离方法，本发明专利技术可以快速、简便和有效地从临床样本中分离到具备体外生长增殖、克隆形成和对抗肿瘤药物耐受能力的细胞团，并且其传代细胞在具备一定的稳定性，是分离和鉴定其中存在的高致瘤性的源头细胞的基础。在目前难以在原代组织中获得足够性状稳定的细胞研究肝癌干细胞及其生活的微环境的条下，研究这些细胞团的细胞组成及在其表现出的维持肿瘤细胞持续增长、耐药和致瘤性中发挥的作用，能够帮助研究者逐步缩小搜索范围，从而最终锁定导致肝癌形成和治疗后复发的元凶肝癌干细胞，结合研究其特定微环境来探索对临床治疗有借鉴价值的可行方案。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤组织细胞和肿瘤组织细胞原代培养领域，尤其涉及一种肝癌临床标本中性状相对稳定的高生长增殖和致瘤能力及高耐药能力的肝癌细胞亚群的体外获取方法。
技术介绍
目前认为肿瘤细胞具有异质性(heterogeneous)，其中少量癌干细胞，表现出更强的生长增殖、致瘤性和对抗肿瘤药物的耐受能力，是肿瘤形成和维持以及治疗后复发的源头细胞，找到这些细胞并确定其细胞生物学特点有助于发展新的诊疗方案实现恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗方案，降低其发生率和致死率。1997年发现粒细胞性白血病中存在能在免疫缺陷鼠体内大量扩增的白血病干细胞亚群，实体瘤癌干细胞便成了研究者搜寻的目标。2003年，Al-Hajj等报道的人乳腺癌干细胞和Singh等报道的人脑瘤干细胞为这一研究拉开了序幕。随后，在肺癌]、前列腺癌、 胰腺癌、结肠癌和肝癌等恶性肿瘤中先后报道了少量细胞亚群表现出癌干细胞特性。以往的研究发现原发性肝癌组织及相关组织中，能检测到⑶133表达于肝硬化假小结外周的卵圆或立方形的肝细胞，或汇管区附近由胆管上皮细胞和肝细胞过渡区域的与成熟肝细胞相比体积较小的细胞，这些细胞符合肝干细胞的结构特点；而肝癌细胞系中CD133+细胞表现出更强的致瘤性，因此认为⑶133+细胞是肝脏癌变的起源细胞(tumor initiating cell), 或癌干细胞样细胞(Cancer stem-like cell)，⑶133是肝癌干细胞的表面标志得到多家研究机构的认同。与此同时，肝癌细胞系中的侧群细胞(Side Population)表现出的癌干细胞样特征也被报道。随后，研究者在肝癌细胞系中报道了根据不同方法得到的细胞亚群具有肝癌干细胞(Cancer Stem Cell)或癌前体细胞(HCC progenitor-like cells)特性， 如⑶90+肝癌细胞，0V-6+和内源性Wnt/ β -Catenin活化的肝癌细胞，表达胰岛素样生长因子-1受体和表皮生长因子受体的肝癌细胞，Epcam+肝癌细胞及⑶13+细胞等。而在⑶133+ 细胞群内，研究者又分别分离出ALDH+或CD44+的细胞在其表现出的癌干细胞特性中扮演了更加重要的角色。虽然众多关于肝癌干细胞的报道让其真实面目扑朔迷离，但其中存在更强生长增殖、致瘤和耐药能力的细胞亚群得到越来越多的支持证据，而细胞表面表达CD133 的细胞亚群得到了多家机构研究结果的支持。目前大部分关于癌干细胞的研究结果都是基于已经建成的肿瘤细胞系，尤其是肝癌干细胞研究更是主要集中于在肝细胞癌细胞系筛选具有更强致瘤性的细胞亚群，对癌干细胞特性的主要考量是其致瘤性，即分选细胞后进行体外成瘤实验或免疫缺陷鼠体内成瘤实验。我国HBV发病率高，相关的肝癌发病率和致死率都非常高，结合肝癌临床样本寻找肝癌干细胞为临床治疗提供参考是非常切实意义的工作。而临床肝癌样本大多伴有较严重的肝纤维化，难以获得活力和数量足够的细胞来完成分选和必要的鉴定，难以在此基础上分离鉴定具有肝癌干细胞特性的细胞亚群。以往的研究表明，即便是癌旁肝组织，接种免疫缺陷鼠BNX皮下能够观察到肿瘤结节的形成，这提示其中存在具有致瘤性能力的功能单位，而需要对目前分离和鉴定肝癌干细胞的策略进行适当的调整。根据干细胞与其生长的微环境(Niche)的关系，研究者认为癌干细胞至少应该具备自我更新、分化和归巢等基本特性，而正是这些特性造成癌干细胞表现出肿瘤生成和耐药等细胞生物学行为，而癌干细胞所有基本特性和表现行为受其Niche对它的支持和调控。肝细胞癌干细胞生长Niche特异性结构目前虽然尚无定论，纤维化是HBV相关的肝癌病程中的一个重要环节，成纤维细胞被认为在肝癌的病程具有非常重要的支持作用。但目前得到广泛认同的其中存在支持肝癌干细胞生长的niche。临床样本中分离得到的单个肝癌细胞在传代过程中分化和难以观察到致瘤能力的原因可能是因为被消化过程损伤或离开支持和调控其生长的微环境相关。因此，分离具有一定数量细胞的细胞团，如果能获得在体外生长增殖、致瘤性和耐药等特性上具有一定优势，并且其传代细胞能够表现出与原始标本比较一致的性状，可以为从临床肝癌样本中分离和鉴定肝癌干细胞提供基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一种临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，包括以下步骤(1)收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化制备组织团和细胞悬液；(2)将组织团和细胞悬液稀释先后用IOOum和40um孔径的滤网过滤，分别收集能通过 40um滤网的细胞悬液和能通过IOOum滤网而不能通过40um滤网的细胞团；结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率，能通过40um孔径滤网的组分以单细胞为主要组分，能通过IOOum滤网而不能通过40um滤网组分为9- (23. 8士6. 9)个细胞组成的细胞团；(3)与能通过40um孔径滤网的以单细胞为主要组分的细胞悬液相比，能通过IOOum滤网而不能通过40um滤网的细胞团在体外原代培养中表现出明显显著的体外生长能力、耐药能力和克隆形成能力；(4)通过IOOum滤网而不能通过40um滤网的组织细胞团，从原代培养得到传代细胞与病理标本在抗人H印atocyte、CK18、CK19和⑶133等蛋白的表达上基本一致。本专利技术的有益效果是，本专利技术可以快速、简便和有效地从临床样本中分离到具备体外生长增殖、克隆形成和对抗肿瘤药物耐受能力的细胞团，并且其传代细胞在具备一定的稳定性，是分离和鉴定其中存在的高致瘤性的源头细胞的基础。在目前难以在原代组织中获得足够性状稳定的细胞研究肝癌干细胞及其生活的微环境的条下，研究这些细胞团的细胞组成及在其表现出的维持肿瘤细胞持续增长、耐药和致瘤性中发挥的作用，能够帮助研究者逐步缩小搜索范围，从而最终锁定导致肝癌形成和治疗后复发的元凶——肝癌干细胞，结合研究其特定微环境来探索对临床治疗有借鉴价值的可行方案。附图说明图1是分离细胞生长曲线(P<0.05)；图2是药物阿糖胞苷对分离细胞的生长抑制图(P<0. 05)； 图3是药物甲氨喋呤对分离细胞的生长抑制图(P<0. 05)。具体实施例方式通过机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化结合获得单细胞悬液和细胞团，比较它们在体外培养过程中生长、克隆形成和耐药能力的差异，发现其中能通过 IOOum滤网而不能通过40um滤网的组分中，存在9- (23. 8 士6. 9)个细胞组成的细胞团， 在体外即能表现出更强的持续生长、体外克隆形成和对抗肿瘤药物的耐受能力，同时其传代细胞能维持表达与组织样本相当的蛋白标志。该专利技术包括以下步骤1、收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、IV型胶原酶和DNA酶联合消化制备组织团和细胞悬液。其中，制备组织细胞悬液的实施步骤为1. 1、手术完成后30分钟内取Edmondson-Steiner病理分级确定为II - III级肝癌组织 l-2cm3置于预冷4°C无钙镁HBSS离心管中；1. 2、生物安全柜内用组织冲洗液冲洗5遍，在该溶液中除去白色纤维状组织、血凝块、 组织碎片及明显坏死的组织后，取1. 2-1. 6g组本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种临床肝癌样本中样本能够维持肝癌特性的细胞团的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）收集临床标本，利用机械分离和透明质酸酶、ＩＶ型胶原酶和ＤＮＡ酶联合消化制备组织团和细胞悬液；（２）将组织团和细胞悬液稀释先后用１００ｕｍ和４０ｕｍ孔径的滤网过滤，分别收集能通过４０ｕｍ滤网的细胞悬液和能通过１００ｕｍ滤网而不能通过４０ｕｍ滤网的细胞团；结合苔盼蓝染色方法细胞计数和统计细胞成活率，能通过４０ｕｍ孔径滤网的组分以单细胞为主要组分，能通过１００ｕｍ滤网而不能通过４０ｕｍ滤网组分为９－２９（２３．８±６．９）个细胞组成的细胞团；（３）与能通过４０ｕｍ孔径滤网的以单细胞为主要组分的细胞悬液相比，能通过１００ｕｍ滤网而不能通过４０ｕｍ滤网的细胞团在体外原代培养中表现出明显显著的体外生长能力、耐药能力和克隆形成能力；（４）通过１００ｕｍ滤网而不能通过４０ｕｍ滤网的组织细胞团，从原代培养得到传代细胞与病理标本在抗人Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ、ＣＫ１８、ＣＫ１９和ＣＤ１３３等蛋白的表达上基本一致。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：殷胜勇，谢海洋，周琳，郑树森，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86