一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用。所述的产表阿霉素的基因工程菌，是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～9所示。所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，其含有核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示的dnmV基因破坏用质粒。所述产表阿霉素的基因工程菌拥有极高的产表阿霉素的能力，最高产量达到201mg/L，效率高、收率高。该基因工程菌获得后能够直接再培养基上发酵获得表阿霉素，操作步骤少而简便，环保节能。

A production of epirubicin gene engineering bacteria and its application

The invention provides a method for producing epirubicin gene engineering bacteria and its application. The production of genetically engineered bacteria epirubicin, transformation of recombinant vector containing a posse of Streptomyces keto reductase gene (Streptomyces peucetius) is built, the nucleotide sequence of the keto reductase gene sequence as a sequence table No.1 ~ 9 ID SEQ shown. The posse for the destruction of the dnmV gene of Streptomyces dnmV modified failure strains, dnmV gene containing nucleotide sequences such as SEQ sequence list ID No.28 shown damage by plasmid. The production capacity of genetically engineered bacteria with high yield of epirubicin epirubicin, the highest yield reached 201mg/L, high efficiency, high yield. The gene engineering bacteria obtained after fermentation medium can directly obtain epirubicin, fewer steps and simple operation, energy saving and environmental protection.

【技术实现步骤摘要】
一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体地涉及一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用。
技术介绍
表阿霉素是一种蒽环类抗生素，分子式为C27H29O11N，为细胞周期非特异性药，对处于S期细胞的作用最强，对M、G1和G2期也有作用，是目前临床应用最广泛的抗肿瘤药物之一。表阿霉素与阿霉素的区别只是在氨基糖部分4’位的羟基构型不同，而这种立体结构的细微变化导致表阿霉素的心脏和骨髓毒性明显降低。表阿霉素与阿霉素的结构式参见式Ⅰ，其中阿霉素的R1为H，R2为OH；而表阿霉素的R1为OH，R2为H。目前表阿霉素主要以柔红霉素或阿霉素为原料通过化学半合成进行生产。这种化学半合成方法不仅收率较低，而且反应步骤多，操作繁琐，并会造成环境污染。而目前还没有通过基因改造的方法，实现直接发酵生产表阿霉素的任何报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在只能通过化学半合成方法制备表阿霉素，收率低、步骤多、操作繁琐、会产生污染的缺陷，提供了一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用。本专利技术人经过深入的研究和反复的试验，发现通过利用dnmV基因破坏用质粒构建波塞链霉菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～9所示。

【技术特征摘要】
1.一种产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，其是将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.1～9所示。2.如权利要求1所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.28所示。3.如权利要求2所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，所述波塞链霉菌为常规的波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)ATCC27952。4.如权利要求2或3所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，所述dnmV破坏株由包括以下步骤的制备方法制得：(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)的dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.28所示；(2)、将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株。5.如权利要求4所述的产表阿霉素的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中，获得所述插入终止密码子的dnmV基因的方法为重叠PCR法，所述重叠PCR法所使用的引物Dau5-HindIII、dnmV3-84、dnmV5-84和Dau3-XbaI的核苷酸序列依次如序列表SEQIDNo.19～22所示；步骤(2)中，所述接合前包括选择安普霉素抗性株的步骤；或者，所述接合后包括选择安普霉素敏感性菌株的步骤。6.一种产表阿霉素的基因工程菌的制备方法，其特征在于，其包括以下的步骤：(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.28所示；(2)、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈少欣，王晓茹，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海,31